新孢子虫NcGRA7基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

吴保义， 陈正鹏， 李红旺， 金春梅， 梁晚枫， 于龙政

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

犬新孢子虫(Neosporacaninum)是一种专性细胞内寄生的顶复门原生动物寄生虫，主要寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内[1]。犬新孢子虫侵入过程复杂，是多个蛋白质分子参与调控机制以及宿主细胞内多个因子相互作用而完成的。该过程包括虫体对宿主细胞的识别和依附，入侵宿主细胞，在细胞内建立纳虫空泡并分裂增殖，纳虫空泡破裂虫体释放，再次入侵新的细胞。

酵母双杂交技术主要是基于对酵母菌转录因子GAL4性质的研究设计而成，1989年由Fields等提出并初步建立[2]。该技术灵敏度非常高，目前在很多蛋白间关系鉴定试验中已经广泛应用[3]。Liu Q等[4]以TgGRA15为诱饵，将TgGRA15克隆到pGBKT7载体中并在Y2HGold酵母菌株中表达，筛选酵母双杂交cDNA文库，首次揭示了与TgGRA15相互作用的新的宿主细胞蛋白。新孢子虫致密颗粒蛋白(dense granules proteins, GRAs)对纳虫空泡的形成及其功能的发挥具有重要作用。

本研究为了筛选出与新孢子虫致密颗粒NcGRA7蛋白相互作用的宿主细胞蛋白质，构建并鉴定了诱饵载体pGBKT7-NcGRA7。

1 材料与方法

1.1 试剂

新孢子虫Nc-1株，pGBKT7，pMD-19T(Simple)，DH5α保存于延边大学农学院生物技术实验室，DNA提取试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒以及EcoRⅠ、SalⅠ均购买于TaKaRa公司。2×Taq Master Mix购自北京佳兰生物科技有限公司

1.2 引物设计与合成

依据GenBank中已经发表的新孢子虫GRA7的基因序列，应用Oligo 6.0软件设计引物NcGRA7-ES-fullR和NcGRA7-EN-commonF，在华大基因科技股份有限公司合成。

1.3 新孢子虫基因组DNA提取

将保存的虫株复苏并接种于Vero细胞，培养2～3 d，观察到速殖子后根据TaKaRa公司DNA提取试剂盒提取新孢子虫株的基因组DNA。

1.4 PCR扩增NcGRA7基因

以提取的新孢子虫株的DNA为模板，PCR体系为20 μL：NcGRA7-ES-fullR，NcGRA7-EN-commonF各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，DNA模板 2 μL。

反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃ 7 min。

1.5 pMD-19T(simple)-NcGRA7构建

将扩增出的目的片段用胶回收试剂盒进行回收后与pMD-19T(simple)连接，连接体系：NcGRA7 PCR产物 4.5 μL，pMD-19T (Simple)0.5 μL，Ligation SolutionⅠ5 μL。16 ℃连接12 h，连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞后涂布于Amp抗性的LB固体培养基，挑取单个菌落接种到Amp抗性的LB液体培养基中，使用质粒提取试剂盒提取质粒，经过酶切鉴定后，阳性质粒送往生物公司测序，测序正确将其命名为pMD-19T(simple)-NcGRA7。

1.6 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7的构建

将测序成功的pMD-19T(simple)-NcGRA7质粒以及pGBKT7载体用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，胶回收后，使用T4连接酶16 ℃连接12 h，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于Kan抗性的LB固体培养基，经过挑菌，摇菌及酶切鉴定后将阳性质粒送往生物公司测序。

1.7 NcGRA7基因的序列比对

应用分子生物学软件GENETYX对测序后的NcGRA7基因序列与GenBank中(登录号：U82229)NcGRA7基因进行比对。

2 结果与分析

2.1 PCR结果

以新孢子虫Nc-1株的DNA为模板，以NcGRA7-ES-fullR和NcGRA7-EN-commonF为引物扩增，PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳得到约570 bp片段，与预期大小一致(图1)。

M：DL 2 000 Marker；1：扩增产物；2：空白对照

2.2 pMD-19T(simple)-NcGRA7酶切鉴定

将NcGRA7的PCR产物与pMD-19T(simple)连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，构建的重组质粒经过PCR初步鉴定后，用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，质粒切出目的条带约为570 bp，与预期大小一致(图2)。

图2 pMD19T-NcGRA7质粒酶切鉴定

2.3 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7的酶切鉴定

用EcoRⅠ和SalⅠ分别对pMD-19T-NcGRA7以及pGBKT7进行双酶切，胶回收后进行连接，转化。经过PCR初步鉴定后得到阳性质粒，再进一步酶切鉴定，对阳性进行双酶切，得到与之前一致的约570 bp大小片段(图3)。

图3 pGBKT7-NcGRA7质粒酶切鉴定

2.4 NcGRA7基因的序列比对分析

将去掉信号肽和疏水区的NcGRA7基因测序后，和GenBank中(登录号：U82229)NcGRA7基因进行序列比对分析，结果表明，试验所获得的NcGRA7基因与GenBank中(登录号：U82229)NcGRA7基因同源性100%(图4)，可用于后续研究。

3 讨论与结论

利用酵母双杂交系统可以从cDNA文库和基因文库中筛选出与构建的诱饵载体所表达蛋白相互作用的蛋白，以此来得到相关的受体，并进一步绘制出蛋白质相互作用图谱，可以增加对入侵机理的了解[5]。该试验研究的NcGRA7基因序列中无内含子，其含有1个信号肽序列和1个跨膜区[6]，NcGRA7蛋白是一种新孢子虫速殖子，其特异性表达的致密颗粒抗原[7]，相对分子质量约为33 ku，该蛋白中包括3个疏水区，其中，第3个疏水区是跨膜区，表明了NcGRA7对空泡的形成和膜的表面修饰起到一定的作用。NcGRA7蛋白在1998年由Jacobs等筛选得到[8]。Huang等通过ELISA鉴定得出NcGRA7可能在寄生虫诱导的流产中起作用[9]。Jenkins等通过质粒DNA免疫研究证实了NcGRA7可以作为免疫原[10]。但目前对NcGRA7蛋白的具体功能缺乏了解。

为筛选出与NcGRA7相互作用的蛋白，进一步探索新孢子虫入侵机理和制备疫苗，该试验构建了酵母双杂交诱饵载体。鉴于pMD19T(Simple)载体连接条件简便、连接效率高，试验将NcGRA7基因先与pMD19T(Simple)连接，获得两端有EcoRⅠ、SalⅠ黏性末端的NcGRA7基因后，再连接到pGBKT7载体上。

本试验通过提取新孢子虫Nc-1株的DNA，经过PCR扩增得到NcGRA7基因，并将其克隆到pMD19T(simple)载体。经过测序以及序列分析鉴定，与NCBI基因库中的NcGRA7基因序列比对结果一致。再将得到的目的基因克隆到pGBKT7载体上，成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7，为后续试验酵母双杂交鉴定奠定基础。

图4 NcGRA7基因的核苷酸序列比对