食管癌组织中VEGF-C表达量与淋巴管新生及肿瘤组织生长的相关性

(河北大学附属医院 胸外科，河北 保定 071000)

食管癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，早期诊断率较低且预后较差、死亡率较高。淋巴结转移是食管癌重要的转移途径，区域淋巴结转移是造成肿瘤复发、远处转移的主要原因，也是导致预后不良的重要因素[1-2]。局部组织中新生淋巴管生成是造成癌细胞淋巴结转移的关键环节，但关于食管癌组织中淋巴管新生的调控机制尚未阐明。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是VEGF家族中具有促进淋巴内皮细胞增殖、诱导新生淋巴管生成作用的成员，已有研究证实食管癌组织中VEGF-C的阳性表达率高于癌旁组织及正常组织[3]。但是，关于VEGF-C与食管癌组织淋巴管新生、病灶生长的关系仍未见明确报道。本研究分析食管癌组织中VEGF-C表达量与淋巴管新生、肿瘤组织生长的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床标本

选取2012年4月-2015年10月在河北大学附属医院接受手术切除的食管癌组织作为临床标本，共86例。其中，男性47例，女性39例；年龄(62.89±7.93)岁；根治性手术63例，姑息性手术23例；中高分化47例，低未分化39例；TNMⅠ、Ⅱ期44例，TNM Ⅲ、Ⅳ期42例；有淋巴结转移49例、无淋巴结转移37例。所有患者术前均未接受过放化疗，手术后经病理切片确诊为食管癌。术后将手术切除的食管癌标本分为2份，一份用石蜡包埋、另一份用液氮冷冻。

1.2 免疫组织化学染色结果判读方法

选择石蜡包埋的食管癌组织，制作石蜡切片后采用武汉博士德生物有限公司SP法免疫组织化学染色试剂盒进行实验，脱蜡至水后滴加3%过氧化氢、37℃、5 min，清洗2～3次后将切片浸入枸橼酸缓冲液并进行抗原热修复15 min，而后分别加入VEGFC、淋巴管特异性标志物D2-40的第一抗体，37℃孵育1 h后清洗，滴加第二抗体后37℃孵育30 min，DAB显色、苏木精复染，最后进行脱水以及中性树脂封片。

1.3 免疫组织化学结果判读方法

VEGF-C定位于胞浆中、镜下呈棕黄色判断为阳性，随机观察5个高倍视野并计算阳性细胞所占比例，将染色明显、定位明确且阳性细胞＞20%的组织切片判断为VEGF-C阳性；D2-40定位于毛细淋巴管内皮细胞的胞浆，在低倍镜下观察并选取淋巴管最丰富的区域，转换为高倍视野并对D2-40阳性染色的淋巴管数目进行计数。

1.4 荧光定量聚合酶链反应检测

选择液氮冷冻的食管癌组织，采用动物组织总RNA抽提试剂盒和cDNA第一链合成试剂盒进行实验，抽提食管癌组织中的RNA并逆转录为cDNA。取cDNA样本，设计细胞增殖标志物Ki-67和细胞周期素B1(Cyclin B1)的特异性引物并进行荧光定量聚合酶链反应，根据荧光定量聚合酶链反应的扩增曲线计算Ki-67和Cyclin B1的mRNA含量。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较用t检验，计数资料以例(%)表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床病理特征食管癌组织中的VEGF-C表达量及淋巴管密度

不同性别、年龄食管癌组织中VEGF-C的阳性率及淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD)差异无统计学意义(P＞0.05)；低未分化食管癌组织中VEGF-C的阳性率及LVD与中高分化比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，低未分化均高于中高分化；TNMⅢ、Ⅳ期食管癌组织中VEGF-C的阳性率及LVD与TNMⅠ、Ⅱ期比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，TNM Ⅲ、Ⅳ期均高于TNMⅠ、Ⅱ期；有淋巴结转移的食管癌组织中VEGF-C的阳性率及LVD与无淋巴结转移比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，有淋巴结转移均高于无淋巴转移的食管癌组织。见表1。

2.2 不同临床病理特征食管癌组织中的增殖分子表达量

不同性别、年龄食管癌组织中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；低未分化食管癌组织中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量与中高分化比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，低未分化均高于中高分化；TNM Ⅲ、Ⅳ期食管癌组织中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量与TNMⅠ、Ⅱ期比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，TNM Ⅲ、Ⅳ期均高于TNMⅠ、Ⅱ期；有淋巴结转移的食管癌组织中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量与无淋巴结转移的比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，有淋巴结转移均高于无淋巴结转移的食管癌组织。见表2。

表1 不同临床病理特征食管癌组织中的VEGF-C表达量及LVD

2.3 不同VEGF-C表达量食管癌组织中的LVD及增殖分子表达量

VEGF-C阳性表达的食管癌组织的LVD以及Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量与VEGF-C阴性表达的食管癌组织比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，VEGF-C阳性表达均高于VEGF-C阴性表达。见表3。

表2 不同临床病理特征食管癌组织中的增殖分子表达量 (±s)

表2 不同临床病理特征食管癌组织中的增殖分子表达量 (±s)

临床病理特征例数Ki-67t值P值Cyclin B1t值P值年龄≥60岁381.07±0.14 0.4920.108 1.03±0.12 0.3740.142＜60岁480.97±0.110.96±0.11性别男471.05±0.12 0.2270.227 1.06±0.14 0.3150.193女390.98±130.94±0.10分化程度高中分化470.65±0.080.57±0.07 14.5850.002低未分化391.39±0.231.49±0.18 11.9410.003 TNM分期Ⅰ、Ⅱ440.61±0.070.65±0.08 13.4220.0019.3840.007Ⅲ、Ⅳ421.45±0.261.37±0.16淋巴结转移无490.57±0.07 18.7690.000 0.46±0.06 22.6270.000有371.60±0.271.79±0.22

表3 不同VEGF-C表达量食管癌组织中的LVD及增殖分子表达量 (±s)

表3 不同VEGF-C表达量食管癌组织中的LVD及增殖分子表达量 (±s)

VEGF-C表达LVDKi-67Cyclin B1 VEGF-C阳性(n =48)11.96±1.781.66±0.221.57±0.18 VEGF-C阴性(n =38)5.29±0.760.53±0.070.61±0.08 t值12.32819.76915.527 P值0.0030.0010.002

3 讨论

淋巴结转移是食管癌最常见和最主要的转移途径，它直接决定肿瘤的分期，影响患者的预后。研究淋巴结转移的发生机制和调控因素对食管癌的早期诊断和判断预后有着重要意义[4-5]。VEGF-C是近年来新发现的VEGF家族成员之一，不仅能够促进血管内皮细胞的增殖、诱导新生血管的生成，还能够作用于淋巴管内皮细胞并促进其增殖，进而增加局部组织中新生淋巴管的数目[6-7]。近年来，VEGF-C促进淋巴管新生的作用受到了越来越多的关注，已有研究报道[8-9]食管癌组织中VEGF-C的阳性表达率高于癌旁组织以及正常食管组织且VEGF-C的表达量与肿瘤的临床病理分期有关。本研究中对不同临床病理特征食管癌组织中VEGF-C的表达量进行分析，所得结果与国内学者毛广显[8]以及李幼梅[9]相一致:食管癌的TNM分期越高、分化程度越低，VEGF-C的阳性表达率越高，且发生淋巴结转移的食管癌组织中VEGF-C的阳性表达率高于未发生淋巴结转移的食管癌组织。

食管癌组织中新生淋巴管的生成能够为癌细胞的区域淋巴结转移提供直接通路，淋巴管新生过程越旺盛、肿瘤的进展越迅速。VEGF-C在食管癌中呈高表达的趋势已经得到一致认可，但VEGF-C是否靶向调节食管癌病灶内淋巴管的新生却仍未阐明。为了明确食管癌组织中高表达的VEGF-C对淋巴管新生的调控作用，本研究采用D2-40单克隆抗体对淋巴管内皮细胞进行标记并对肿瘤组织中淋巴管进行计数，由不同临床病理特征食管癌组织中LVD的比较可知:食管癌的TNM分期越高、分化程度越低，LVD越高，且发生淋巴结转移的食管癌组织中LVD高于未发生淋巴结转移的食管癌组织。这就说明肿瘤病灶内的淋巴管新生参与肿瘤的进展、分化和转移过程。进一步分析不同VEGF-C表达情况对LVD的影响可知:VEGF-C阳性表达能够增加食管癌组织的LVD。这就说明食管癌组织中VEGF-C对淋巴管新生具有调控作用，VEGF-C表达越高、淋巴管数目越多。

在食管癌病情的进展过程中，局部新生的淋巴管不仅能够为癌细胞的淋巴结转移提供通路，还能够为肿瘤组织的生长提供所需的营养成分、促进癌细胞的增殖。Ki-67是细胞增殖相关的核抗原，是反映细胞增殖活力的常用指标，其表达量越高、细胞增殖越旺盛；Cyclin B1是调节细胞周期的重要蛋白质，与CDK1结合后能够加速细胞周期的发展、促进细胞的增殖[10-12]。本研究对食管癌组织中Ki-67、Cyclin B1表达量的分析来反映肿瘤病灶内细胞增殖的状态，结果显示，食管癌的TNM分期越高、分化程度越低，Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量越高，且发生淋巴结转移的食管癌组织中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量高于未发生淋巴结转移的食管癌组织。进一步分析不同VEGF-C表达情况对Ki-67、Cyclin B1表达的影响可知:VEGF-C阳性表达能够增加食管癌组织的Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量。这就说明食管癌组织中VEGF-C对细胞增殖具有调控作用，VEGF-C表达越高、Ki-67和Cyclin B1的表达量越高、细胞增殖越活跃。

综上所述，食管癌组织中高表达的VEGF-C与淋巴管新生以及肿瘤组织生长密切相关，VEGF-C能够促进新生淋巴管的形成以及肿瘤组织内细胞的增殖。