间歇性低压低氧对大鼠肺动脉高压的预防作用及血管保护机制

(河北医科大学第一医院 心内科，河北 石家庄 050031)

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension,PAH)是以肺动脉压力升高以及血管痉挛、内膜增生和重构为主要特征的一种病理状态，目前对PAH的发病机制尚未阐明，但已明确内皮功能失调是PAH发生及发展的重要病理生理基础，因此恢复受损的血管内皮功能是治疗PAH的重要策略。间歇性低压低氧(intermittent hypobaric hypoxia,IHH)是指实验动物间断暴露于低压低氧环境，而其余时间处于常压常氧环境中。已有研究表明，IHH对机体有很多益处，但国内外尚未见对PAH大鼠具有预防及保护作用的研究报道。

本实验采用野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导雄性SD大鼠PAH模型，观察IHH对PAH大鼠模型的肺组织及肺血管功能学、形态学的作用，并初步探讨其对肺血管的保护机制，为临床治疗PAH提供新的实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级健康雄性SD大鼠40只购于河北医科大学实验动物中心，体重150～200 g。大鼠随机分为正常对照组8只(CON组)、肺动脉高压组12只(PAH组)、间歇性低压低氧组8只(IHH组)和IHH+MCT组12只。

1.2 实验药品及实验溶液的配置

1.2.1 实验药品 MCT、苯肾上腺素(Phenylephrine,PHE)、乙酰胆碱(Acetylcholine,ACH)、4%水合氯醛溶液。

1.2.2 Krebs-Henseleit(KH)溶液的配制 氯化钠NaCl 3.45 g，氯化钾KCl 0.175 g，氯化钙CaCl20.1 g，磷酸二氢钾KH2PO40.0815 g，硫酸镁MgSO40.148 g，碳酸氢钠NaHCO31.05 g，葡萄糖1.1 g(pH 7.35～7.45)，配置成500 ml溶液。

1.3 实验分组及干预

1.3.1 CON组 大鼠饲养28 d后直接用PE-50管检测右心室收缩压(right heart systolic pressure,RVSP)及肺动脉平均压(mean pulmonary artery pressure,mPAP)，计算右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index,RVHI)，并用血管环灌流实验观察血管反应性的改变。本组实验持续28 d。

1.3.2 PAH组 大鼠先正常饲养14 d，后以60 mg/kg的剂量一次性腹腔注射MCT，以诱导大鼠慢性PAH模型，在注射14 d后测量PAP，如果＞25 mmHg则入组。本组实验持续28 d。

1.3.3 IHH组 大鼠置于模拟5 km海拔高度(氧浓度11.1%，大气压400 mmHg)的低压低氧舱，6 h/d，其余时间仍处在正常氧气及气压条件下，连续经受28 d的IHH后进行实验。本组实验持续28 d。

1.3.4 IHH+MCT组 大鼠先接受上述的低压低氧处理28 d后，用MCT以60 mg/kg剂量一次性腹腔注射，14 d后进行实验。本组实验持续42 d。

1.4 实验方法和步骤

1.4.1 复制PAH模型 PAH组实验大鼠一次性腹腔注射MCT溶液(60 mg/kg)，有研究表明，在注射14 d即可形成理想的大鼠PAH模型[1-3]。该研究在注射MCT后14 d应用Powerlab生物信息采集与处理系统中的肺动脉压力测定模板测量肺动脉压(PAP)，如果PAP＞25 mmHg时，则认为复制模型成功。本实验中大鼠经测量均复制成功。

1.4.2 血流动力学测定 大鼠称重后用水合氯醛行腹腔注射麻醉。启动Powerlab生物信息采集与处理系统，接通三通管后与换能器和监护仪相连，并将压力校零备用。将麻醉后的大鼠暴露右侧颈总静脉后用PE-50管缓缓插入，PE-50管的另一端与压力换能器相连，缓慢操纵导管，根据屏上所显示的压力值与压力曲线的变化来判断导管的位置，当出现典型的右心室压力波形及肺动脉压力波形后，固定导管位置，记录Powerlab生物信息采集处理系统中的RVSP及PAP值，通过数据分析得出mPAP压力值。

1.4.3 RVHI的计算 血流动力学检测结束后迅速开胸，将心脏取出并用K-H液冲洗干净。剪下心脏后沿着房室间沟剪去心房及周围血管组织，之后经肺动脉出口沿肺动脉圆锥、室间隔将右心室游离壁分离，余下的即为左心室及室间隔组织(Left ventricle and septum，LV+S)，用滤纸吸干组织上的水分后秤量RV游离壁以及LV+S的重量，计算RV/(LV+S)%比值即为RVHI，反映肺动脉高压的程度。

1.4.4 大鼠离体肺动脉环的复制 将上述开胸后的大鼠剪取左肺叶置于K-H液硅胶培养皿中并固定，在显微镜下暴露肺叶内的肺动脉及其分支，剥离两侧结缔组织，游离出肺动脉，选取直径介于300～500 μm的肺中动脉剪成长约为2 mm的离体肺动脉环。

1.4.5 肺动脉环体外灌流实验的操作步骤 打开DMT Myograph Systems，将肺血管环悬挂于预置5 ml K-H液的浴槽内，并进行血管的标准化来算出血管的初始张力，基线稳定后用PHE(10-5mol/L)收缩血管环达张力峰值，加入ACH(10-5mol/L)检验血管内皮完整性。反复冲洗，待血管环重新稳定后，加入累积浓度的PHE(10-8～10-5mol/L)，即加入1个浓度的PHE，待反应稳定之后再加入另一浓度，获取浓度-效应曲线反映血管内皮依赖性收缩功能；反复冲洗待血管环张力重新平衡后，用PHE(10-5mol/L)预收缩血管环引起最大收缩反应后，逐渐加入系列浓度梯度(10-8～10-5mol/L)的ACH，从而获得ACH的累积浓度-效应曲线反映内皮依赖性血管舒张功能。

1.5 统计学方法

肺动脉环体外灌流实验的每组数据先分别计算不同浓度梯度下药物对离体肺动脉血管环的收缩或舒张的张力值，然后用血管环的收缩或舒张张力值占PHE(10-5mol/L)的最大收缩百分比表示，并绘出累积浓度-效应曲线。数据分析采用SPSS 17.0统计软件，实验结果均为服从正态分布的计量资料，计量资料以均数±标准差(±s)表示，4组数据比较运用单因素方差分析，当多组间比较有统计学意义时，两两比较应用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的一般生长状况与死亡情况

PAH组大鼠从腹腔注射MCT后1周开始体重较对照组减轻，倦卧，喘促，活动量、进食量减少。处死后开胸，可见肺表面光滑，呈灰白色，弹性差，多处局灶性瘀血，右心室明显增厚。IHH组大鼠的活动度、进食状况及重量均较PAH组有所改善，但较CON组差，处死后见肺表面光滑，呈粉色，但弹性差。CON组大鼠处死后可见肺表面光滑，呈粉红色，富有弹性。PAH组死亡2只大鼠，其余各组大鼠均全部存活。死亡大鼠行解剖实验，肉眼可见有胸腹腔积液，摘取心、肺组织后，可见肺组织瘀点、瘀斑，短轴横切心脏，可看到右室游离壁肥大。

2.2 各组大鼠RVSP和mPAP比较

4组大鼠RVSP和mPAP比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。PAH组的RVSP和mPAP与其他3组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，PAH组高于其他3组；IHH+MCT组大鼠的RVSP和mPAP与PAH组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，IHH+MCT组低；IHH+MCT组、IHH组的RVSP和mPAP与CON组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，IHH+MCT组和IHH组偏高。见表1和图1。

表1 各组大鼠RVSP、mPAP、RV、LV+S及RVHI比较 (±s)

表1 各组大鼠RVSP、mPAP、RV、LV+S及RVHI比较 (±s)

注:1)与CON组比较，P ＜0.05；2)与CON组比较，P ＞0.05；3)与PAH组比较，P ＜0.05

组别RVSP/mmHgmPAP/mmHgRV/mgLV+S/mgRVHI/%CON组(n =8)24.464±1.21416.423±0.4660.103±0.0360.420±0.0280.244±0.038 PAH组(n =10)45.145±0.6231)35.282±0.9461)0.246±0.0631)0.582±0.0321)0.488±0.0281)IHH组(n =8)25.743±1.1632)17.863±0.4282)0.161±0.0272)0.504±0.0322)0.277±0.0422)IHH+MCT组(n =12)27.585±0.9872)3)19.456±1.0352)3)0.125±0.0242)3)0.488±0.0452)3)0.256±0.0412)3)F值11.24710.14319.54825.17924.434 P值0.0000.0000.0000.0000.000

图1 各组大鼠RVSP、mPAP比较

2.3 各组大鼠RV、LV+S和RVHI比较

4组大鼠RV、LV+S、RVHI比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。PAH组的RV、LV+S、RVHI与其他3组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，PAH组高于其他3组，IHH+MCT组的上述指标较PAH组显著降低；IHH+MCT组、IHH组的指标与CON组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但IHH+MCT组和IHH组偏高。见表1和图2。

图2 各组大鼠RV、LV+S和RVHI比较 (±s)

2.4 各组大鼠离体肺动脉的血管功能

在4组中，PHE从10-8mol/L到10-5mol/L均可引起血管内皮依赖性收缩反应，ACH从10-8mol/L到10-5mol/L都可引起血管的内皮依赖性舒张反应，且以上实验药物对血管的收缩及舒张作用都具有浓度依赖性。

2.4.1 离体肺动脉环对PHE的血管内皮依赖性收缩反应 由PHE诱导的肺动脉环的血管内皮依赖性收缩功能PAH组大鼠与CON组大鼠比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，PAH组减弱(见表2)，这种效应在PHE的量效关系曲线上表现为曲线的右移(见图3)。但是，IHH+MCT组的内皮依赖性的收缩功能较PAH组增强，即IHH预处理28 d可改善PAH组大鼠受损的肺动脉内皮依赖性收缩功能。

2.4.2 离体肺动脉环对ACH的血管内皮依赖性舒张反应 ACH诱导的肺动脉环的血管内皮依赖性舒张功能PAH组大鼠与CON组大鼠比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，PAH组减弱(见表2)，这种效应在ACH的量效关系曲线上表现为曲线的右移(见图4)。但是，IHH+MCT组的内皮依赖性舒张功能较PAH组增强，即IHH预处理28 d后可改善PAH组大鼠受损的肺动脉内皮依赖性舒张功能。

图3 各组由PHE诱导的离体肺动脉环的血管内皮依赖性收缩功能比较

表2 各组大鼠累积浓度的收缩及舒张效应 %

图4 各组由ACH诱导的离体肺动脉环的血管内皮依赖性舒张功能比较

3 讨论

已有研究表明，IHH对机体多种组织、器官均有益处[4-6]，例如可保护神经及肝脏等器官组织[7]；可对抗代谢综合征大鼠的血压升高和胰岛素抵抗[8]；也有文献报道IHH可对抗缺血/再灌注所致心功能损伤及心律失常[9]，增强机体对缺血、缺氧的耐受性；SANCHIS-GOMAR[10]等的研究证明IHH对心肌梗死的预防和恢复均有保护作用；FARIAS[11]等的研究也证明IHH对运动员在常氧运动时红细胞的生成、最大摄氧量和能量消耗具有保护作用。有关IHH对机体的有益作用日益受到关注，但其对PAH的预防作用目前国内外报道均少见。

目前关于PAH的发病机制尚未完全阐明，但已明确内皮功能失调是PAH发生及发展的重要病理生理基础[12]。正常情况下血管内皮细胞可分泌内皮依赖性舒张因子(endothelium-derived relaxing factor,EDRF)及内皮依赖性收缩因子(endothelium-dependent contraction factor,EDCF)作用于平滑肌细胞而发挥血管活性作用。如果发生内皮功能障碍，则NO等EDRF减少或活性降低，而O2等EDCF释放增加，使肺血管收缩及重构，最终导致PAH，因此恢复受损的血管内皮功能是治疗PAH的重要策略。

本研究发现，未经过IHH预处理的实验组大鼠MCT腹腔注射后2周，其肺动脉压力升高，右心室肥厚，而这种效应能够被IHH预防治疗所消减。因此得出这样的结论:IHH干预后可降低MCT所诱导的升高的大鼠肺动脉压及右心室肥厚。

LIN等[13]的研究表明MCT诱导的PAH大鼠离体肺动脉由ACH介导的内皮依赖性舒张反应减弱，其潜在的机制可能是血管平滑肌细胞对EDCF的敏感性增高以及对内皮源性的NO的反应性降低[14]。ELIF等[15]将MCT诱导的PAH大鼠于21d后处死，游离出肺动脉主干做离体肺动脉环实验，并使用去甲肾上腺素预收缩肺动脉干后观察其由电场刺激介导的舒张反应，结果显示与正常对照组相比，PAH组电场刺激介导的舒张功能消失，这表明MCT诱导的PAH大鼠电场刺激介导的舒张功能减弱是由于内皮NO的产生受抑制而引发。

本研究在血管环灌流实验中发现，在MCT诱导的PAH组中，由ACH诱导的内皮依赖性血管舒张反应较正常对照组大鼠降低，这与MAM等[16]的研究结果相同。但是，IHH+MCT组的内皮依赖性舒张功能较PAH组增强，即IHH预处理28 d后可改善PAH组大鼠受损的肺动脉内皮依赖性舒张功能。因此，通过上述结果笔者推断早期运用IHH对MCT诱导的PAH大鼠肺动脉的舒张功能具有保护作用，其作用机制可能是由于肺血管结构的改变降低了其对血管收缩物质的反应性，这与WITTMER等[17]的研究相同。也有学者研究证实IHH能够通过开放动脉血管KATP通道和增加NO浓度减缓MCT诱导的PAH的进展，改善内皮依赖性的血管舒张功能[18-19]。

本研究应用先进的DMT Myograph Systems，为临床治疗PAH提供一种预处理的非药物性措施及新的思路，同时也有助于更加深入地理解PAH的病理进展。