中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定

甄浩洋，彭焕，孔令安，洪豹元，朱桂兰，汪锐辉，彭德良，文艳华



中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定

甄浩洋1，彭焕2，孔令安2，洪豹元3，朱桂兰3，汪锐辉3，彭德良2，文艳华1

（1华南农业大学农学院，广州 510642；2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3江西省婺源县植保植检站，江西婺源 333200）

【目的】在江西婺源县孢囊线虫调查中，从大豆根及根际土壤中采集到一个孢囊线虫群体，其形态特征和分子特征与大豆孢囊线虫（）存在较大差异，因此对其形态学和分子特征以及寄生性等进行详细研究，以明确其种类及对豆科作物寄生性，为病害防控提供科学依据。【方法】从婺源县采集的大豆根及根际土样，用筛淘法分离孢囊，大豆根系上的孢囊用直接解剖法获取。用浅盘法分离根际土样中的2龄幼虫和雄虫。选取具典型特征的饱满孢囊制作阴门锥切片，浅盘法分离的2龄幼虫和雄虫制作永久玻片，在显微镜下观察记录孢囊、2龄幼虫和雄虫的形态特征，并进行形态特征测量。采用两对植物线虫通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分别扩增内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS)和28S大亚基D2-D3区段，经序列测定，用MEGA软件采用邻接法（neighbor-joining(NJ)method）构建该线虫群体与孢囊线虫属其他种群的ITS和LUS D2-D3系统进化树，分析其系统发育关系。在温室内采用盆栽人工接种的方法，测定江西孢囊线虫群体对11种豆科作物的寄生性，同时测定国内40个大豆栽培品种对该孢囊线虫的抗病性。【结果】形态学观察和特征值测量结果表明，从江西婺源大豆上采集的孢囊线虫群体，其孢囊形态、2龄幼虫以及雄虫的形态特征与野生豆孢囊线虫（）的形态特征基本一致；ITS序列（MG859982）比对发现其与野生豆孢囊线虫ITS序列（KU160510和KU160512）的同源性为99%和98%，而与大豆孢囊线虫ITS的同源性仅为81% (KY794762.1）。D2-D3序列（MG859981）与野生豆孢囊线虫（KU160511）相似度最高，为99%。序列系统进化树分析发现以ITS序列与D2-D3序列构建系统发育树的结果相一致，江西孢囊线虫群体与野生豆孢囊线虫分布在同一支，节点支持率为100%，而与大豆孢囊线虫聚在另一个分支中。结合形态学和分子生物学结果，将江西婺源大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫，系中国新记录种。寄生性研究结果表明，在参鉴的11种豆科作物中，野生豆孢囊线虫的2龄幼虫能在大豆和相思豆（红豆）上侵染和繁殖，完成生活史；虽然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8种作物根系，但不能完成生活史。测定的40个大豆栽培品种中，19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。【结论】在我国江西婺源新发现的一种寄生于大豆的孢囊线虫为野生豆孢囊线虫, 系中国新记录种；人工接种条件下相思豆（红豆）也是野生豆孢囊线虫的寄主，40个大豆栽培品种中30个对该孢囊线虫表现感病。

野生豆孢囊线虫；中国新记录种；形态学；分子鉴定；寄生性

0 引言

【研究意义】大豆（）是世界上最重要的作物之一，在我国有悠久的种植历史，是我国重要的油料作物。全球大豆种植面积1.02亿公顷，年产量2.54亿吨[1]。影响大豆生产的病害很多，而大豆孢囊线虫病是制约我国大豆生产的主要病害之一。大豆孢囊线虫病在我国东北、华北及黄淮海等大豆主产区广泛分布，一般造成大豆减产5%—10%，严重地块减产30%—50%，甚至绝收[2]，其致病的病原线虫主要为大豆孢囊线虫（）。2015年7月至2016年7月，作者从江西婺源大豆根际土样中及根系上发现一个孢囊线虫群体，其形态特征和大豆孢囊线虫存在较大差异，明确该孢囊线虫群体的种类及其对豆科植物寄生性，对病害防控具有重要意义。【前人研究进展】孢囊线虫系一类定居性的植物内寄生线虫，很多具经济重要性的种类都属于孢囊线虫属（）。目前国内外报道的孢囊线虫属描述的种类有80多个，其中在全球范围内给农业生产造成严重损失的有大豆孢囊线虫甜菜孢囊线虫（）、禾谷孢囊线虫（）等[3-5]。在我国，引起农作物病害的重要孢囊线虫种类主要有大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫（）[6-8]等。近年来国内报道的孢囊属新种有中华孢囊线虫（）[9]、冯氏孢囊线虫（）[10]、海南孢囊线虫（）[11]和广东孢囊线虫[12]（）等；描述的新记录种有旱稻孢囊线虫（）[13]、朝鲜孢囊线虫（）[14-15]等。2016年，kang等[16]描述了一种寄生于大豆的孢囊线虫新种——野生豆孢囊线虫（），该孢囊线虫目前仅在韩国被报道，对于该孢囊的致病性和寄主范围也还未见相关研究报道。【本研究切入点】2015—2016年，在对江西省主要农作物孢囊线虫病害调查中，于上饶市婺源县大豆根际土样及根系上发现一个孢囊线虫群体，该孢囊线虫的形态特征与大豆孢囊线虫有较大差异，有必要明确其种类、寄主范围及致病性等。【拟解决的关键问题】结合形态学和分子生物学方法对采集自江西婺源大豆上的孢囊线虫群体进行鉴定，明确其寄主范围及致病性特点，为今后进一步的研究和防控打下基础。

1 材料与方法

1.1 孢囊线虫的采集、分离与扩繁

大豆根系及根际土壤于2015年7月至2016年7月采自江西省上饶市婺源县万岭村。将带回的大豆根系洗净后在解剖镜下观察，直接解剖法获取根系上的孢囊，土样采用淘洗过筛法分离土样中的孢囊[5]。采用浅盘法分离土壤中的2龄幼虫（J2）和雄虫。

在盛满灭菌沙土（土壤﹕沙=3﹕1）的塑料钵（直径12 cm、高15 cm）中种植和样品采集地所种植的相同大豆品种（婺源罗汉豆），每盆定苗一株，待大豆长至一片真叶时参照Kong等的方法[17]，配制和接种孢囊卵悬浮液，用1 ml的枪头在大豆苗的周围均匀插3个小孔，将卵悬浮液分别从小孔注入后，覆好灭菌土。接种后5 d内不大量浇水，置于25—28℃温室条件下培养。

1.2 形态学观察及测量

选择收集饱满的孢囊，参照冯志新[18]的方法制作阴门锥切片。参照谢辉[19]的方法挑取J2和雄虫制作玻片。65℃水浴加热杀死线虫，用FAA（福尔马林-冰醋酸-乙醇固定液）固定，制作成临时玻片，在Leica光学显微镜（DM2500）下观察、拍照、测量。形态学观察特征及测量值包括J2的体长、最大体宽、口针长、食道长、背食道腺开口到口针基球的距离、尾长及透明尾长；孢囊的形态、孢囊下桥的有无、膜孔及类型、泡状囊泡的有无及阴门裂长度等[5]。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 DNA提取 参考亓晓莉等[20]的方法，挑取田间采集和温室单孢囊扩繁群体中大豆根际土样及根系上的单孢囊，置于含有10 μL双蒸水、3 μL的蛋白酶K（600 mg·ml-1，Roche，德国）和7 μLPCR-buffer缓冲液（含mg2+）（Takara，大连）的离心管中，在液氮中速冻1 min后用灭菌玻璃棒研磨，待冰完全融化后，重复在液氮中速度研磨3次后，置于-80℃条件下至少保存2 h，将离心管转入PCR仪中，进行DNA提取，反应过程如下：65℃下温育90 min，85℃条件下保存10 min，最后4℃保存。DNA提取的产物在12 000 r/min离心1 min，取上清DNA悬浮液于-20℃中保存备用。

1.3.2 序列扩增 以上述单孢囊DNA为模板，参考Cui等[21]的方法，以引物D2A（5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG-3′）和D3B（5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′）扩增核糖体DNA 28S D2-D3区域，以引物AB28（5′-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GT-3′）和TW81（5′-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3′）[22]PCR扩增内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS），PCR扩增体系：模板DNA 2 μL，2×Taq PCR StarMix buffer（Takara,大连）12.5 µL，10 μmol·L-1的引物各0.5 µL，无菌双蒸水补充至25 μL。扩增条件为94℃预变性，5 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环，72℃终延伸10 min，4℃保存。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶分离后，观察照相。扩增产物采用琼脂糖凝胶纯化试剂盒（北京天根生物科技公司）纯化；纯化产物连接到pEASY-T1 Simple载体上（北京全式金生物技术有限公司），热激转化大肠杆菌感受态细胞，经过PCR扩增鉴定得到的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.3 序列分析及系统进化树构建 测序结果采用DNAman和DNAstar 7.01进行去载体和序列拼接后，在NCBI网站进行blastn比对。同时从GenBank下载孢囊线虫其他近缘种的ITS序列和D2-D3区序列，用MEGA 5.0软件，邻接法（neighbor-joining method，NJ）构建该线虫与其他孢囊线虫属ITS序列和D2-D3区序列系统进化树[23-24]。

1.4 寄主范围测定

11种豆科作物21个品种（种子购自兴农种业公司）分别播种到PVC管（直径5 cm、高25 cm）中，播种和人工接种方法如1.1所述，接种量为每株接种1 ml1 200粒/ml的卵悬浮液，每个处理4次重复，设感病大豆（婺源罗汉豆）为对照，温室条件下常规栽培管理。在接种后7 d参照Bybd等[25]的方法取其中两株进行根系品红染色，显微镜下观察线虫侵染情况。在接种后60 d取剩余两株，采用过筛法收集根系和土壤中孢囊于滤纸上统计孢囊数量，计算每个品种剩余两株的平均孢囊数。

1.5 抗病性测定

同1.4中的方法种植40个大豆栽培品种（来自黑龙江、辽宁、河北、河南、江西等省份）并参照1.1接种野生豆孢囊线虫卵粒，每株接种1 ml1 200粒/ml的卵悬浮液，每个品种设置4次重复，设置感病品种（婺源罗汉豆）为对照，在日光温室25—28℃条件下常规栽培管理。在接种后第60天取PVC管采用过筛法收集根系和土壤中孢囊于滤纸上统计孢囊数量，计算每个品种各重复的平均孢囊数和孢囊指数（公式1）并对其进行抗性评价。

孢囊指数=（供试品种的平均孢囊量/感病对照品种的平均孢囊量）×100% （1）

按 Schmitt等[26]提出的鉴定大豆抗病性的IP标准进行分级：高抗0—9%（VR），中抗 10%—30%（MR），中感31%—60%（MS），高感＞60%（VS）。

2 结果

2.1 形态学观察与测量值

显微镜下对孢囊、2龄幼虫（J2）和雄虫的形态学进行观察和测量，形态学测量和文献记述比较见表1。中国江西大豆根上孢囊线虫群体的描述如下。

表1 野生豆孢囊线虫中国江西群体形态特征测量值

孢囊：虫体柠檬形或近圆形，与大豆孢囊线虫相比更圆，阴门锥突出较不明显；雌虫颜色白色，成熟以后孢囊呈深褐色或亮黑色，有明显的颈（图1-C、1-D）；阴门区双半膜孔，无下桥和囊泡，极少存在卵囊团（图2）。J2：杀死固定时，虫体向腹部微弯，呈线形（图3-F）；口针粗壮，口针基部球卵圆形，头部缢缩不明显，头架明显（图3-D）；侧区4条侧线；尾圆锥形，尾端尖，透明尾长占尾长的53%—66%（图3-E、3-F）。雄虫：杀死固定时，虫体向腹部弯曲，轻微的呈弓形（图3-C）口针粗壮，口针基部球卵圆形，食道腺发育良好，有发达的椭圆形中食道球（图3-A）。交合刺明显，弯曲呈弓形。尾部很短，末端呈圆形（图3-B）。

A：根系上的孢囊Cyst on the roots；B：根系上的白雌虫Female on the roots；C、D：孢囊Cyst

图2 孢囊阴门锥特征

A：雄虫体前端Anterior body portion of male；B：雄虫尾部Tail of male；C：雄虫Entire of male；D：2龄幼虫体前部Anterior body portion of J2；E：2龄幼虫尾部Tail of J2；F：2龄幼虫Entire of J2

2.2 分子生物学鉴定

测序结果表明，孢囊线虫婺源群体的ITS的扩增片段长度为1 033 bp（GenBank登录号MG859982），28S D2-D3区片段长度755 bp（MG859981），Blast分析结果表明，该群体的ITS序列与GenBank收录野生豆孢囊线虫韩国群体的ITS序列（KU160510和KU160512）相似度分别为99%和98%，其次为麦类孢囊线虫（）（HM560790），相似度为83%，与大豆孢囊线虫（ KY794762.1）相似度只有81%。扩增得到D2-D3序列与野生豆孢囊线虫韩国群体的（KU160511）相似度最高为99%，与旱稻孢囊线虫（）（HM560842），相似度为95%，与大豆孢囊线虫（LC208677）相似度为91%。从田间采集样本和温室扩繁的样本中获得的孢囊线虫相应序列完全一致，无任何单碱基差异。

基于ITS序列和28S D2-D3序列构建的系统进化树分析结果表明（图4、图5），以ITS序列和D2-D3序列构建的发育树结果相一致，采集自江西大豆上的孢囊群体与来自韩国的野生豆孢囊线虫聚在同一支，置信度为100%，与旱稻孢囊线虫、广东孢囊线虫等莎草孢囊线虫群组（）[27]聚在一个大的分支中，而大豆孢囊线虫与甜菜孢囊线虫、三叶草孢囊线虫（）等甜菜群组（）[28]聚在另外一个分支。

2.3 寄主范围测定

11种豆科作物21个品种在人工接种野生豆孢囊线虫后7 d，经染色观察发现J2能够侵染大豆、相思豆、豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤小豆、刀豆、四季豆和苜蓿10种豆科作物，但是只有在大豆和相思豆（红豆）的根系上能够发现豆荚形的3龄幼虫（J3），而在其他豆科作物上发现J2的侵染点都产生了较为严重的褐变（图6）。在接种后60 d经过检测，仅在大豆和相思豆（红豆）上能够产生孢囊，完成生活史（表2）。

图4 利用邻接法构建的江西孢囊线虫种群与其他孢囊线虫种的ITS序列系统进化树

图5 利用邻接法构建的江西孢囊线虫种群与其他孢囊线虫种的LUS D2-D3序列系统进化树

2.4 抗病性测定

40份大豆栽培品种中对野生豆孢囊线虫表现高抗的品种有5个，中抗的品种有5个，中感品种有11个，高感品种有19个。结果表明参鉴品种中75%的大豆栽培品种对来自江西的野生豆孢囊线虫表现感病（表3）。

3 讨论

形态学观察和测量结果表明，采集自中国江西大豆根上的孢囊线虫群体与韩国的野生豆孢囊线虫[16]形态学特征基本一致。江西群体的孢囊个体较韩国群体孢囊略小（中国江西种群/韩国种群：体长495.0 μm/513.0 μm，体宽448.0 μm/416.0 μm）。江西群体与韩国群体就阴门锥特征相比膜孔较小，中国江西群体/韩国群体：膜孔长33.0 μm/41.0 μm，膜孔宽26.0 μm/37.0 μm）。可能是生态环境、地域差异造成，大豆品种的不同也可能对群体分化存在一定的影响[29]；中国江西群体2龄幼虫（J2）、雄虫与韩国群体J2、雄虫相比形态学特征测量结果较为一致（表1）。孢囊形态观察韩国群体没有能够观察到卵囊团[16]，而中国江西群体极少但能观察到卵囊团。形态学鉴定结果认为江西大豆根上孢囊线虫群体与韩国野生豆孢囊线虫一致，而与大豆孢囊线虫相比有较大差别，野生豆孢囊线虫的孢囊形态更圆，表皮有光泽，无下桥和囊泡。

a：大豆Glycine max；b：相思豆Abrus precatorius；c：豇豆Vigna unguiculata；d：豌豆Pisum sativum；e：扁豆Lablab purpureus；f：绿豆Vigna radiata；g：赤豆Vigna angularis；h：刀豆Canavalia gladiata；i：菜豆Phaseolus vulgaris；j：苜蓿Medicago sativa

表2 野生豆孢囊线虫江西群体对豆科作物的寄主范围测定

表3 大豆栽培品种对野生豆孢囊线虫江西种群抗性鉴定

野生豆孢囊线虫于2016年由Kang等[16]在韩国大豆上发现并首次报道，目前还未在其他国家和地区被发现报道，也未见关于其致病性与寄生性方面的报道。在研究野生豆孢囊线虫对豆科作物寄主范围测定中，通过根系染色观察到在J2侵染时期，在非寄主或不良寄主的根系内J2侵染点附近会产生较为严重的褐化现象（图6），可能是因为线虫侵染导致的免疫反应，使得孢囊线虫不能建立取食位点，最终造成其不能完成生活史。栽培大豆品种的抗性鉴定结果表明，在参与鉴定的40个大豆栽培品种中感病品种所占比例较高，目前国内多数大豆栽培品种对该孢囊线虫没有抗性。国内外的生产实践表明在大豆孢囊线虫病的防治中，培育抗病品种是最经济有效的方法[30]，因此通过筛选对野大豆孢囊线虫具有抗性的大豆种质资源具有重要意义。

大豆孢囊线虫病在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、山西、山东、河南、河北、安徽、江苏、浙江、广西和江西等省（自治区）均有不同程度发生[31]。此次报道的野生豆孢囊线虫系我国寄生于大豆上的孢囊线虫新记录种，目前仅在韩国和中国江西被发现。我国其他省份是否有该孢囊线虫发生分布还有待于进一步调查明确。鉴于韩国和中国江西两地纬度跨度较大，涵盖了我国东北、华北和黄淮海等主要的大豆种植区，与大豆孢囊线虫的主要发生分布区域一致[31]，并且本研究在种群扩繁时，在北京夏天室外盆栽种植大豆接种后该孢囊线虫也能够较好的寄生和完成生活史，综合以上情形推测该孢囊线虫对于环境有较好的适应性，在我国大豆主产区能够生存繁殖，因此有必要引起重视。

4 结论

依据形态学和分子生物学特征，将采自中国江西大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫，系中国一新记录种；寄主范围测定结果表明大豆和相思豆（红豆）是其适宜寄主；对野生豆孢囊线虫的抗性鉴定表明，40个国内大豆栽培品种中有19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。

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（责任编辑 岳梅）

, a new cyst nematode record in China and its parasitism to legume crops

ZHEN HaoYang1,2, PENG Huan2, KONG LingAn2, Hong BaoYuan3, Zhu GuiLan3, Wang RuiHui3, PENG DeLiang2, WEN YanHua1

(1College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642;2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;3Station of Plant Protection and Inspection, Wuyuan 333200, Jiangxi)

【Objective】In a survey for cyst nematodes in Jiangxi Province, China, a cyst nematode population was collected and extracted from soybean roots and rhizosphere soil. The morphological characteristics of this population are different from that of the soybean cyst nematode (). The objective of this study is to research morphological and molecular characteristics and parasitism test of this population, identify their species and parasitism to legume crops, and to provide scientific basis for disease prevention and control.【Method】Soil samples were collected in Wuyuan County, Shangrao City, Jiangxi Province. The cysts were collected by sieving method or dissected from the roots. The 2nd stage juveniles (J2s) and males in soil were extracted by using the shallow disk method. The cysts with typical characteristics were selected to make a slice of the vulva cone, the J2s and males separated by shallow disk method were made into permanent slides. Morphological characteristics of cysts, J2s and males were observed and measured under microscope. For molecular studies, single cyst from soybean roots was picked and then ground to extract the genomic DNA. The ribosomal RNA-ITS region and the D2-D3 expansion segments of 28S large subunit rRNA gene were amplified with universal primers AB28, TW81 and D2A, D3B, respectively. The sequencing results were deposited in the GenBank database and compared with nematode sequences using the BLAST homology search program. The closest sequences were selected for phylogenetic analyses. The MEGA software was used to construct the ITS and LUS D2-D3 phylogenetic tree of cyst nematodes using neighbor-joining method. The parasitism of this cyst nematode to 11 legume crops and 40 soybean cultivars was tested by artificial inoculation in greenhouse. 【Result】Morphological characteristics of cysts, J2s and males of population in this study agreed withreported in Korea. Sequence from the ITS-rDNA (MG859982) was 99% and 98% identical to those offrom Korea (KU160510 and KU160512) and only 81% identical to the soybean cyst nematode () (KY794762.1). The D2-D3 (MG859981) sequence was 99% identical tofrom Korea (KU160511). In addition, analysis of phylogenetic trees constructed by the ITS and LUS D2-D3 both showed that the Jiangxi population andwere grouped in the same clade with a reliability of 100%. The cyst nematode population from Jiangxi was identified asa new record species in China. Inoculation of 11 legume crops showed that J2s ofcould infect 10 crops (soybean, jequirity, cowpea, pea, lentil, mung bean, adzuki bean, sword bean, green beans and alfalfa), but could complete the life cycle only on soybean and jequirity. Soybean cultivars resistant identification test results showed that 19 cultivars of the 40 inoculated soybean cultivars were highly susceptible, 11 cultivars were moderately susceptible, 5 cultivars were moderate resistant and 5 cultivars were highly resistant.【Conclusion】The population of cyst nematode collected on soybean from Jiangxi, China was identified as- a new cyst nematode record in China. Parasitism tests indicated that soybean and jequirity were suitable hosts for, and 30 of the 40 soybean cultivars were susceptible to phenotypic disease of cyst nematodes.

; new record in China; morphology; molecular identification; parasitism

2018-02-28；

2018-04-16

国家公益性行业（农业）科研专项（201503114）

甄浩洋，E-mail：Zhy910801@163.com。通信作者彭德良，E-mail：pengdeliang@caas.cn。通信作者文艳华，E-mail：yhwen@scau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.007