原料豆粉对儿童营养配方粉储藏期品质劣变的影响

寻崇荣，王冬梅，吴长玲，王中江，江连洲，李 杨，范志军

(1黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，哈尔滨 150036；2东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

婴儿配方奶粉是为满足不同市场需求而在生产加工过程中向牛奶中添加各种营养成分，以满足不同年龄组营养需求的调配奶制品[1]。配方奶粉在室温下于密封袋或密封罐等厌氧环境中储存，其保质期通常为12～24个月[2]。研究表明，奶粉品质在储藏期间劣化的原因非常复杂，可能是物理反应，也可能是脂质氧化和美拉德反应等化学反应引起的风味劣变，或者是影响配方奶粉品质的各种因素相互影响，导致配方奶粉品质劣变[3-4]。产品风味是导致消费者接受程度的重要指标，配方奶粉在储藏期间会产生不同程度的异味，这些异味成分存在潜在毒性，以减少配方粉营养价值，异味来源可能是由脂肪氧化、蛋白氧化及美拉德反应等产生醛类物质引起[5]。

豆粉中含有丰富的营养物质及大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆卵磷脂等功能性成分，成为儿童营养配方粉的主要原料[6]，故而优先考虑原料豆粉的储藏期品质失稳对配方粉风味劣变影响规律。豆粉中不饱和脂肪酸的氧化产物主要是氢过氧化物—高活性分子，其生成后迅速分解，产生挥发性及非挥发性化合物组成的复杂混合物，如烃类、醛类和酮类物质，会影响产品的整体质量，另外，这些氧化产物可能与蛋白结合，产生异味成分[4，7]。其中醛类在风味改变和毒理学方面尤为重要[7]。在豆粉制取工艺中的预处理环节中，随着大豆细胞结构被破坏，多不饱和脂肪酸很容易在脂肪氧合酶的催化下发生脂质过氧化反应，产生自由基和活性次生氧化产物，可能会诱导大豆蛋白氧化。蛋白质氧化是蛋白质分子在ROS直接作用下，或通过次生氧化产物间接作用于蛋白质而导致的蛋白质共价结构修饰。蛋白质氧化是影响食品质量的重要因素，是导致蛋白质营养损失、风味恶化以及功能性质下降的重要原因。鉴于此，本项目分析了蛋白质氧化值变化规律，具体蛋白质氧化值依据羰基含量的测定方法，原理是蛋白在储藏期间与氧气、油脂及金属离子相互作用而形成羰基，主要是N末端连接的α-氨基、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸及脯氨酸侧链等发生自由基传递反应，导致氨基酸残基破坏产生羰基(醛基和酮基)[8-9]。随着储藏时间不同，原料豆粉的蛋白氧化程度也有差异，可能会形成醛类、酮类等物质以影响配方粉的风味品质，卢静[9]的研究表明，豆粉在储藏期间，蛋白羰基含量随储藏时间的延长有增加趋势，说明豆粉中蛋白可能发生了部分氧化。而美拉德产物也可能是豆粉的呈味途径，美拉德后期产物对豆粉品质有重要影响，故需对不同储藏期原料豆粉的美拉德产物形成规律进行分析。

目前，制备豆粉最常用的是传统湿法工艺，其过程一般是将大豆浸泡后进行热烫、磨浆、分离、煮浆处理，再经浓缩、均质及喷雾干燥制得豆粉[5]。本研究通过分离分级技术抽提不同储藏期内原料豆粉的油脂、蛋白质等组分，通过研究确定引起儿童营养配方粉风味劣变的可能原因，重点分析豆粉油脂氧化、蛋白氧化及美拉德反应产物对配方粉风味劣变的影响规律，为保持配方奶粉的原始口感、延长货架期提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆，哈尔滨九三油脂集团；大豆磷脂，周口慧洋饲料有限公司；婴儿配方粉，黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司；实验所需基础试剂均为分析纯，北京化学试剂公司。

1.2 仪器

70型浆渣分离磨浆机，沈阳玉祥机械设备有限公司；Ultra-Turrax T25高速分散器，德国IKA公司；喷雾干燥机，无锡昂益达机；AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；电热恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂；酶标仪SH-1000，日本Corona electric公司；RE-205型旋转蒸发仪，上海予华仪器设备有限公司；高速离心机，德国 Eppendorf 公司。

1.3 豆粉的制备

大豆→浸泡→热烫→磨浆→浆渣混合物→浆渣分离→豆乳→酶解→灭酶→高压均质→调配→浓缩→喷雾干燥→豆乳粉。

参照齐宝坤等[6]的方法称取一定量大豆于烧杯中，用浓度为0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水热烫5 min，按豆水比1∶7的比例添加pH为6.5～7.0的90℃弱碱水进行磨浆得浆渣混合物，然后浆渣分离得豆乳，将分离后的豆乳在95℃下，煮浆20 min，添加2%的乳化剂大豆磷脂进行调配混匀，将调配好的豆乳进行真空浓缩至豆乳固形物含量达15%左右，然后在进口温度为185℃、出口温度为85℃条件下进行喷雾干燥即得豆粉，将得到的豆粉进行密封室温保存。

1.4 儿童营养配方粉的制备

参照夏明敬[12]的方法，将制备的豆粉与购买的婴儿配方粉原料按照23∶100的比例进行配比并配制成溶液，在进口温度为180℃、出口温度为80℃的条件下喷雾干燥，得到儿童营养配方粉，密封室温保存备用。

1.5 原料豆粉及儿童营养配方粉油脂的提取

采用索氏抽提法利用正己烷与石油醚混合溶剂抽提豆粉及儿童营养配方粉中的油脂，抽提温度为55℃，抽提油脂与混合溶剂进行旋转蒸发处理，挥去混合溶剂组分获取油脂，将抽提出的油脂置于-20℃冰箱避光备用，进行酸价、过氧化值及丙二醛值测试。

1.6 酸价、过氧化值及丙二醛值的测定

参考 GB /T 5530—2005测定酸价；参考GB /T 5538—2005测定过氧化值；参考GB/T 5009.181-2003修正优化测定丙二醛值。

1.7 原料豆粉脂肪氧化酶活性的测定

参考石胜尧[17]等的方法，采用分光光度法对样品中脂肪氧化酶含量进行测定，准确称取0.10 g样品，用5 mL蒸馏水、5 mL硼酸缓冲液溶解于试管中，缓慢振动0.5 h，用滤纸过滤，将滤液定容至50 mL容量瓶。脂肪氧化酶活性为50 000 U/mg，准确称量0.001 9 g脂肪氧化酶，用蒸馏水定容至10 mL容量瓶中，浓度为0.001 9 g/mL。分别取0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mL脂肪氧化酶加入带有刻线的试管中，每个试管中加入0.025 mL亚油酸钠，然后分别用硼酸缓冲液定容至3 mL，用移液枪取20 μL，于酶标仪在234 nm处测定酶反应的吸光值，每0.5 h记录1次吸光值，得到OD变化的最大值，以脂肪氧化酶浓度为横坐标，ΔOD/min值为纵坐标，作出脂肪氧化酶标准曲线(图1)。

取0.01 mL大豆提取液，加入0.025 mL亚油酸钠，用pH为9.0的硼酸缓冲液定容至3 mL。用移液枪取20 μL，酶标仪在234 nm处测定酶反应的吸光值，每0.5 h记录1次吸光值，得到OD变化的最大值。样品中的脂肪氧化酶活性按式(1)计算：

(1)

式(1)中，X-样品中脂肪氧化酶活性(U/mg)；M-脂肪氧化酶浓度(μg/mL)；m1-样品的质量(μg)；V1-样品稀释的体积(mL)；V2-测量时取的样品稀释液的体积(mL)；V3-硼酸溶液定容后的体积(mL)。

1.8 原料豆粉及儿童营养配方粉蛋白的提取

参照李淑芬等[10]的方法，将豆粉及儿童营养配方粉用正己烷进行脱脂处理，然后用碱溶酸沉法提取脱脂豆粉中的蛋白，冷冻干燥后于4℃保存备用。

1.9 羰基含量的测定

参照卢静[9]和Levine[11]等的方法，测定样品蛋白中的羰基含量。

(2)

1.10 采用OPA法追踪豆粉的美拉德产物

参考刘振春等[21]的方法，准确称取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸钠(SDS)2.5 mL、硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL、β-巯基乙醇100 μL，最后用蒸馏水定容到50 mL。测定时，取4.0 mL OPA试剂于试管中，加入200 μL样品，混合均匀，放入35℃水浴中反应2 min后在340 nm下测吸光值A340，另取4.0 mL OPA试剂于试管中，加入200 μL水作为空白对照。接枝度可以用式(3)计算：

DG(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(3)

式(3)中,A0：接枝反应前溶液的吸光值；A1：接枝反应后溶液的吸光值。

1.11 数据处理

每组试验都进行3次平行试验，并将试验数据进行误差分析。采用统计学软件SPSS 18对试验数据进行方差分析、相关性和差异显著性分析；采用Origin 8.5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同储藏期原料豆粉及儿童营养配方粉油脂氧化程度变化规律

2.1.1储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉酸价的影响 酸价是评价油脂氧化过程中产生酸性物质量的一个有效指标，酸价可以作为评价其氧化程度的敏感指标之一[13]。由图2可知，储藏时间不超过8个月时，原料豆粉及儿童营养配方粉的油脂酸价随储藏时间的延长有增加趋势，但变化不明显(P>0.05)，表明8个月储藏期内原料豆粉及儿童营养配方粉的油脂氧化程度相对较低；储藏时间超过8个月后，油脂酸价随储藏时间的延长显著增加(P<0.05)，可见长期储藏时，原料豆粉及儿童营养配方粉中的油脂组分均发生了“氧化”现象。对比儿童营养配方粉与其原料豆粉可知，随着储藏时间的延长，两种样品的酸价变化趋势相同，说明原料豆粉对儿童营养配方粉的油脂氧化有一定作用；储藏时间超过8个月时，儿童营养配方粉提取油脂的酸价高于原料豆粉，原因可能是儿童营养配方粉辅料部分催化了油脂的氧化作用，其中ZnO属于高活性氧化催化剂，以致相同储藏期内，儿童营养配方粉的酸价较高。儿童营养配方粉配料中的维族元素具有一定的抗氧化性，但酸价仍然较高于原料豆粉，原因可能是辅料中全脂乳粉的油脂发生了氧化，进而影响整体风味[14-15]。

图1 脂肪氧化酶标准曲线

图2 储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉酸价的影响

图3 储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉过氧化值的影响

2.1.2储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉过氧化值的影响 由图3可知，随着储藏时间的延长，油脂过氧化值整体呈现逐渐增大的变化趋势，说明原料豆粉及儿童营养配方粉随着储藏期的延长均出现了缓慢的自动氧化作用；且两者的过氧化值随储藏时间的延长有相同的变化趋势，说明儿童营养配方粉在储藏过程中的品质劣变与原料豆粉油脂氧化有一定的相关性。储藏8个月的原料豆粉样品的油脂氧化值较高，此结果部分证实了油脂氧化是风味劣变的可能原因[16]。储藏时间超过6个月时，儿童营养配方粉提取油脂的氧化值显著高于原料豆粉样品，此结果进一步证实了酸价分析中的推论。由于相同储藏时间内植物油脂过氧化值应低于动物油脂，因此，本结果中儿童营养配方粉中油脂的过氧化值高进一步证实了全脂乳粉可能发生了较大程度氧化，并诱导了豆粉中油脂的氧化。

2.1.3储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉丙二醛生成量的影响 由图4可知，储藏时间不超过4个月时，原料豆粉及儿童营养配方粉的丙二醛生成量变化不明显，说明短期储藏不会影响样品的品质劣变；储藏期延长到6个月时，原料豆粉的丙二醛含量增加不明显，但儿童营养配方粉的丙二醛生成量显著增加，说明儿童营养配方粉中的全脂乳粉发生了氧化，导致儿童营养配方粉的丙二醛生成量较高。储藏时间超过6个月后，原料豆粉及儿童营养配方粉丙二醛含量显著增加(P<0.05)，说明长期储藏时，豆粉油脂逐步氧化形成过多的氧化终产物，丙二醛含量增加，一定程度上导致儿童营养配方粉氧化程度增加，丙二醛含量增多，且相同储藏期内儿童营养配方粉的丙二醛含量相对较高，原因是植物性油脂氧化产生的丙二醛量较动物性油脂少，儿童营养配方粉中的全脂乳粉可能继续发生氧化，以致儿童营养配方粉的丙二醛生成量较高。储藏期8个月时，原料豆粉的丙二醛生成量增幅最大，原因可能是8个月左右的储藏期是原料豆粉末端氧化发生的重点时期，也是“氧化味”产生的主要时期。

2.1.4储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉脂肪氧化酶活性的影响 由图5可知，随着储藏时间的延长，原料豆粉及儿童营养配方粉中的脂肪氧化酶活性并未发生显著变化。说明原料奶粉及儿童营养配方粉风味劣变的原因并非源自酶促氧化，结合脂肪氧化程度结果分析可知，品质劣变可能是由脂肪的自动氧化引起，在长期储藏下，原料豆粉及儿童营养配方粉的脂肪氧化程度逐渐增大，可能与脂肪氧化的链式反应有关[18-19]，油酸、亚油酸、亚麻酸氧化产生醛类物质及氢过氧化物，这些物质经过裂解产生己醛，进一步反应会导致原料豆粉及儿童营养配方粉风味劣化[15]。

2.2 不同储藏期原料豆粉及儿童营养配方粉蛋白氧化程度的变化规律

由附表可知，原料豆粉及儿童营养配方粉的蛋白质羰基含量随储藏时间的延长有增加趋势，但变化不明显。由刘晶[20]的研究结果可以看出，丙二醛含量增加会引起大豆蛋白羰基含量增加，说明原料豆粉及儿童营养配方粉的脂肪氧化可能促进蛋白的氧化，以致蛋白羰基含量增加，但蛋白羰基含量在储藏期间变化不明显，说明蛋白氧化并非是影响儿童营养配方粉风味劣变的主要原因。

附表 蛋白氧化程度结果

2.3 不同储藏期原料豆粉及儿童营养配方粉美拉德产物的形成规律

接枝度的高低反映了美拉德反应产物形成的多少，接枝度较高，表明样品发生美拉德反应的程度较强。由图6可知，原料豆粉及儿童营养配方粉的接枝度随储藏时间的延长有增加趋势，但变化不明显，说明美拉德反应对原料豆粉及儿童营养配方粉品质劣变的影响较小。通过对比发现，原料豆粉与儿童营养配方粉在加工过程中美拉德产物形成差异不明显，说明储藏期间儿童营养配方粉发生的美拉德反应主要是由原料豆粉引起的。

图4 储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉丙二醛生成量的影响

图5 储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉脂肪氧化酶活性的影响

图6 储藏时间对原料豆粉及儿童营养配方粉美拉德反应的影响

3 结论

本文对不同储藏期间儿童营养配方粉及其原料豆粉的油脂及蛋白成分进行了研究，通过油脂的过氧化值、酸价、丙二醛含量分析不同储藏期的油脂氧化程度；采用分光光度法对脂肪氧化酶活性进行测定；通过羰基含量的测定，确定不同储藏期内样品的蛋白氧化程度；采用OPA法豆粉追踪美拉德产物，确定美拉德反应产物对配方粉风味劣变的影响。结果发现，储藏期间原料豆粉及儿童营养配方粉的品质劣变主要是由油脂自动氧化引起的，蛋白质氧化和美拉德反应对原料豆粉及儿童营养配方粉品质劣变影响较小；且原料豆粉与儿童营养配方粉的油脂氧化变化趋势相同，对儿童营养配方粉的品质劣变有一定促进作用，但全脂乳粉可能也对儿童营养配方粉的油脂氧化变质有一定作用。◇