硫化氢对长期过量饮酒小鼠心肌纤维化及miR-221表达的影响

肖 婷 宋宗仁 刘鸿涛 郭亚芹 张 乐 王 芳 杨 军

(深圳市龙华区中心医院心血管内科，广东 深圳 518110)

心肌在长期过量饮酒情况下，可出现许多的病理改变，心肌纤维化是其中重要的病理改变之一〔1〕。而心肌纤维化常常是导致许多心血管疾病发生心律失常和发展为心力衰竭的关键环节。微小RNA(miRNA)是一类长度20～25个核苷酸大小、机体内源性表达的单链非编码RNA分子，具有负向调节基因表达的功能。miRNAs通过与靶mRNA的3′-非编码区特定序列互补配对，引起翻译抑制或结合后降解，进而对基因表达进行转录后负向调控。基于此生物学功能，其参与了调控机体许多重要的生物学过程，如细胞增殖、分化、衰老及癌变〔2～4〕。有证据表明，miRNAs可通过调控靶基因的表达，参与调控心肌纤维化过程〔5〕。研究证实，硫化氢(H2S)在心血管系统中具有广泛的生物学效应，可在多种心肌损伤模型中发挥心肌保护作用〔6〕。有研究还显示H2S可改善长期摄入酒精导致的左室重构〔7〕。本研究旨在探讨H2S对酒精性心肌纤维化的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、药品与试剂 44只健康雄性昆明小鼠，体重16～21 g，由南华大学实验动物中心提供。硫氢化钠(NaHS)和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)由 Sigma公司提供。Trizol试剂由Invitrogen公司提供。逆转录试剂盒由Fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1分组、模型建立及干预方案 44只小鼠随机分为4组：对照组、模型组、NaHS组和PAG组，其中对照组与模型组每组各10只，NaHS组与PAG组每组各12只。实验前在实验室适应性喂养1 w，使小鼠适应环境。模型组、NaHS组及PAG组小鼠经连续12 w每日自由饮用4%(V/V)的乙醇水溶液(4%的乙醇水溶液是唯一饮用水源)制作酒精性心肌纤维化模型〔8〕，对照组予以每日自由饮用清洁水。造模开始的同时，NaHS组给予每天腹腔注射NaHS溶液(50 μmol/kg)，PAG组给予每天腹腔注射PAG溶液(40 mg/kg)。对照组与模型组给予每天腹腔注射等体积生理盐水。

1.2.2标本采集 造模第12 w末时，采用腹腔注射水合氯醛对小鼠进行麻醉，固定小鼠，打开胸腔，快速取出心脏，去除心包膜、血管等其他组织，用冰生理盐水冲洗干净，滤纸弄干。取左室部分心肌迅速放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，用于行VG染色和Ⅰ型胶原免疫组化。取部分左室心肌组织冻存于-80℃冰箱，用于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测。

1.2.3VG染色观察心肌胶原沉积 取4%多聚甲醛固定后的心肌组织，行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后，制备组织切片，切片厚度约4 μm，然后进行VG染色，间质胶原纤维呈红色，于光镜下观察。

1.2.4免疫组化检测心肌组织Ⅰ型胶原表达 石蜡包埋4%多聚甲醛固定的心肌组织，制备组织切片。切片常规脱蜡和水化，3%过氧化氢(H2O2)处理，抗原修复。以正常山羊血清封闭，滴加稀释一抗Ⅰ型胶原抗体(1∶100)，37℃孵育90 min。磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS漂洗，显色剂显色。然后以苏木素复染，脱水、透明，封片，镜检。最后在显微镜下进行观察，胞质内出现棕色定位明确的颗粒物质为阳性细胞表达。

1.2.5RT-qPCR检测miR-221的表达 取-80℃冻存的心肌组织，按照Trizol试剂说明提取心肌组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。逆转录试剂盒购自Fermentas公司，按照说明转录得到cDNA。选用U6为内参。引物序列(5′-3′)如下：U6：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；mir-221：ACCTGGCATACAATGTAGATTTC。PCR反应体系如下：Template(反转录产物)1 μl，引物A (10 μmol/L)0.5 μl，引物B(10 mol/L)0.5 μl，PCR H2O 13 μl，2×SYBR Green PCR混合物15 μl 。PCR扩增程序：95℃预变性10 min,随后进入循环，95℃变性5 s,60℃退火延伸30 s,进行40个循环。数据采用2-ΔΔCt法分析。

1.3统计学处理 应用SPSS18.0 软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1心肌组织VG染色结果 模型组心肌组织中红染的胶原纤维较对照组明显增多，即心肌纤维化加重。NaHS组心肌组织中红染的胶原纤维较模型组明显减少，即心肌纤维化减轻。PAG组与模型组相比，红染胶原纤维进一步增多，心肌纤维化更为明显。见图1。

2.2Ⅰ型胶原蛋白免疫组化结果 模型组心肌组织中棕黄色阳性物质显著多于对照组，即模型组Ⅰ型胶原蛋白表达显著高于对照组。NaHS组棕黄色阳性物质较模型组显著减少，即NaHS组Ⅰ型胶原蛋白表达较模型组显著降低。相反，PAG组与模型组相比，棕黄色阳性物质进一步明显增多，即Ⅰ型胶原蛋白表达进一步显著升高。见图2。

图1 各组心肌组织VG染色结果(×100)

图2 各组心肌组织Ⅰ型胶原的表达(DAB，×400)

2.3各组心肌组织miR-221表达水平比较 模型组心肌组织中miR-221表达水平(1.67±0.12)显著高于对照组(1.00±0.05，P<0.05)，NaHS组心肌组织中miR-221的表达水平(1.28±0.03)较模型组显著下降(P<0.05)，PAG组(2.12±0.12)与模型组相比，miR-221表达水平进一步明显增高(P<0.05)。

3 讨 论

研究证实长期大量饮酒可导致出现以心脏扩大、肌纤维结构紊乱、收缩功能下降为特征的心肌重构〔9,10〕。同时，心肌纤维化也是慢性酒精性心肌损伤发生的一个重要环节。过量摄入酒精可使心肌细胞受损，从而继发心肌成纤维细胞增殖和基质胶原纤维蛋白分泌的增加，形成心肌纤维化〔11〕。本实验结果同样证实了长期过量饮酒可导致心肌纤维化发生。

H2S是近年来发现的一种小分子气体递质，可以自由渗入细胞膜发挥生物效应。在哺乳动物体内，H2S可通过酶促反应途径产生，由磷酸吡哆醛-5′-磷酸依赖酶，主要为胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)，催化底物L-半胱氨酸而成。其中CBS主要高表达于脑组织中，而CSE 主要存在心血管组织中。H2S在心血管系统中具有重要的调节功能，参与调控许多心血管疾病的发生发展过程。Mani等〔12〕发现内源性H2S可通过抑制血管内膜的增殖和黏附分子的表达保护血管免受粥样硬化损伤，而减少内源性H2S生成可加速血管动脉粥样硬化的发展。Zhou等〔13〕在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病心肌病模型中发现，H2S可通过抗炎、抗氧化应激及抗细胞凋亡等机制减慢糖尿病心肌病的发展。本研究结果提示H2S可有效减轻酒精性心肌纤维化。

有研究发现miRNAs参与高血压、心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、心肌病等多种心血管疾病的心肌纤维化过程，具体机制为直接抑制多种细胞外基质蛋白的表达或参与调控多条与心肌纤维化相关的信号通路〔14〕。miR-221是一种广泛存在于各种组织中的miRNA。苏明〔15〕通过构建心肌特异miR-221转基因小鼠，结果发现小鼠在大约1月龄时心脏明显扩大，心脏重量指数明显增大，心肌纤维化程度显著增加。而其具体机制与miR-221调控p27/CDK2/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路介导的自噬有关。长期过量饮酒在引起小鼠心肌纤维化的同时，可以上调miR-221的表达，这提示miR-221可能参与了酒精性心肌纤维化的发展过程。而H2S在减轻酒精性心肌纤维化的同时可下调miR-221的表达，这提示下调miR-221的表达可能是H2S减轻酒精性心肌纤维化的重要内在机制。

综上所述，我们初步认为H2S具有改善长期过量饮酒导致的心肌纤维化的作用，其内在机制可能与H2S下调miR-221的表达有关，而其详细的机制有待进一步研究。