小麦胚芽作为意大利蜜蜂春繁期饲料蛋白源的研究

魏伟 郗学鹏 张卫星 刘振国 王红芳 马兰婷 胥保华

摘要：為探究春繁时期小麦胚芽在蜜蜂代花粉饲料中的适宜添加比例，在春繁前期，将意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）姊妹王群，随机分为5组，每组3群，其中A组为对照组，B、C、D、E分别为添加小麦胚芽25.00%、45.00%、65.00%、83.74%的试验组。试验期共36 d，记录期间蜂群的采食量和蜂群群势，第21 d采集各群新出房工蜂，测其初生重并在之后14 d，解剖标记蜜蜂观察中肠组织发育状态，测定中肠消化酶活性；测定1日龄和14日龄工蜂的抗氧化基因SOD1、SOD2、CAT mRNA表达量。结果表明，D、E组蜜蜂采食量显著低于其它组（P<0.05）；D组蜂群群势增长显著高于其它组（P<0.05）；C组工蜂初生重最大，且显著高于B组（P<0.05）；C组蜂群的中肠组织发育状态显著优于A、D、E组（P<0.05）；D组工蜂中肠蛋白酶活性最强，且显著高于B、E组（P<0.05）；随着饲料中小麦胚芽添加比例的升高，抗氧化基因SOD1表达量无显著差异， SOD2、CAT基因的表达量呈现下降趋势。由此得出，饲喂小麦胚芽添加水平为45.00%～65.00%的代花粉饲料，可以促进蜂群群势的增长，提高工蜂初生重，促进中肠发育，提高中肠蛋白酶活性，但会下调SOD2与CAT基因的表达。

关键词：春繁；小麦胚芽；意大利蜜蜂；群势；初生重；中肠组织

中图分类号：S893.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0119-07

Abstract To explore the appropriate proportion of wheat germ in the feed replacing pollen during spring multiplication， the Apis mellifera L. swarms were randomly divided into 5 test groups， each group of 3 swarms. Among them， group A was as the control， and B， C， D and E were as the experimental ones with the wheat germ proporation of 25.00%， 45.00%， 65.00% and 83.74%， respectively. During 36-day trial， the intake of swarm and the colony development were recorded. On the 21st day， the birth weight of new bees was measured， and 14 days later， the marked bees were dissected to observe the development of intestinal tissue and measure the digestive enzyme activity of midgut. The expressions of SOD1， SOD2 and CAT mRNA were detected in 1- and 14-day-old worker bees. The results showed that the feed intake of bees in D and E groups was significantly lower than that of the other groups （P<0.05）. The increase of colony population of group D was significantly higher than that of the other groups （P<0.05）. The birth weight of worker bees in group C was the largest and significantly higher than that of group B （P<0.05）. The development status of midgut tissue in group C was significantly better than that of group A， D and E （P<0.05）. The intestine protease activity of worker bees in group D was the strongest and significantly higher than that of group B and E （P<0.05）. With the increase of the proportion of wheat germ in feed， there was no significant difference in the expression level of antioxidant gene SOD1， while that of SOD2 and CAT genes showed decreasing trends. It was concluded that when the wheat germ proportion was 45.00%～65.00%， it could promote the growth of bee colonies and improve the birth weight of worker bees， promote the development of middle intestine and improve the activity of mesenteric protease， but reduce the expression of SOD2 and CAT genes.

Keywords Spring multiplication； Wheat germ； Apis mellifera L.； Population of colony； Birth weight； Midgut tissue

蜂群经过寒冷的越冬期，从蜂王开始产卵到流蜜期到来为蜜蜂的春繁階段[1]。春繁阶段是蜜蜂生长发育的重要阶段，期间蜂群群势的增长为一年的稳产和高产奠定了重要基础[2]。然而，早春时期天气寒冷，蜂群内花粉储备不足，外界无蜜粉源等一系列因素，严重制约了蜂群的发展。花粉是蜜蜂的主要饲料之一，为个体的生长发育提供蛋白质，是蜂群繁衍生存的主要营养源[3，4]。蛋白质是保证幼虫发育、蜂群群势恢复的重要营养素[5，6]。由于天然花粉价格昂贵、供应不足，故而常人工制作代花粉饲料替代花粉饲喂蜂群[7，8]。研究表明，小麦胚芽中至少含有30%的蛋白质，富含各种氨基酸，尤其是其它谷物中缺少的赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸[9-13]。小麦胚芽中还含有丰富的脂肪酸、矿物质和维生素，特别是维生素C和维生素E含量尤其高。本试验通过研究小麦胚芽在代花粉饲料中的不同添加水平对蜜蜂春繁时期群势、采食量、工蜂出生重、中肠发育状态、酶活和相关基因表达量的影响，探究其在蜜蜂代花粉饲料中合适的添加比例，以期为蜜蜂饲料中添加小麦胚芽提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年2月21日至4月21日在山东农业大学试验蜂场进行，选取意大利蜜蜂姊妹王群（Apis mellifera L.）为试验对象。

1.2 试验设计

春繁初期，选取15群意大利蜜蜂，随机分为5组，每组3个重复，每个重复3“足框蜂”。以小麦胚芽、油菜花粉、蔗糖、预混料为原料配制代花粉饲料，试验组饲喂小麦胚芽添加水平分别为25.00%、45.00%、65.00%、83.74%（质量比）的代花粉饲料，对照组饲喂油菜花粉[14，15]。各组饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 蜂群管理

试验开始前，进行为期12 d的预试验，对所有蜂群进行逐一检查，保证每群蜂群势基本一致。正式试验期为36 d，期间所有处理组均选用孔径较小的脱粉器控制外勤蜂采集花粉，并在框梁上饲喂试验日粮。各组试验日粮分别按粉状饲料∶蔗糖∶水=1∶1∶0.2的比例混合均匀后反复揉搓，直到无块状、能攥成团状为止，盖上保鲜膜过夜，使水分被充分吸收，制成粉饼[16]。

1.4 指标测定

1.4.1 蜂群采食量测定 正式试验开始后，将粉饼放在框梁上供蜜蜂自由采食，为避免水分散失，粉饼上方覆盖一层保鲜膜，同时在蜂场中放置一空蜂箱，放入粉饼，每6 d更换一次饲料，并记录剩余的饲料重量，保证蜂群蜜粉充足。用ACS-ZL型电子天平称量记录每次饲喂的料重以及剩料重，并称量空箱中粉饼的重量记录水分散失，共统计6次，计算每群蜜蜂的总采食量和各处理粉料摄入量。

总采食量=饲喂料重-剩料重-水分散失；

粉料摄入量=总采食量-蔗糖含量-水含量。

1.4.2 蜂群群势测定 正式试验开始后，每隔12 d对蜂群群势进行测定，记录其群势增长脾数，共统计3次。蜂群群势以“足框蜂”来衡量。

1.4.3 工蜂初生重测定 向蜂箱中插入一张空巢脾，蜂王产下卵记为第1 d，21 d后，取刚羽化出房的蜜蜂21只，每7只放入已知重量的离心管中，用电子天平（0.000 1 g）称重，其平均值记为蜜蜂初生重[17]。

1.4.4 工蜂中肠组织发育状态 用记号笔标记新出房蜜蜂，每箱100只。第14 d取标记蜜蜂10只，将其中肠取出后，放入多聚甲醛固定液中，用于制作中肠组织切片。分别用显微镜在40×和200×放大倍数下对中肠组织结构进行观察，在100×放大倍数下对中肠肠壁厚度和隐窝深度进行记录。

1.4.5 工蜂消化酶活性测定 第14 d取标记蜜蜂30只，取样方法同1.4.4，每10只蜜蜂为一个重复，将完整的中肠拉出，立即置于液氮、-80℃保存备用。按质量体积比制备10%的组织匀浆，用于测定胃蛋白酶、蔗糖酶、淀粉酶活性。胃蛋白酶、蔗糖酶、淀粉酶测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，使用 UV-2450 紫外分光光度计测定。

1.4.6 工蜂体内SOD1、SOD2、CAT基因表达量测定 新蜂、14日龄工蜂样品用匀浆机打碎，采用Total RNA kit Ⅱ（OMEGA，USA）试剂盒提取总RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche，USA）试剂盒将提取的总RNA样品反转录为cDNA，-20℃保存备用。参照 Fast Start Universal SYBR Green Master（Roche，USA）试剂盒的说明书配置 20 μL 体系，ABI 7500系统测定目的基因的相对表达量。定量引物的设计及合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物信息见表 2。

1.5 数据分析

采用 SAS 9.2 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），多重比较采用 Duncans法，P<0.05表示差异显著。数据均用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同小麦胚芽添加比例对蜂群采食量的影响

如表3所示，随代花粉饲料中小麦胚芽添加水平的升高，采食量呈现降低趋势。D、E两组的采食量显著低于A、B、C三组。

2.2 不同小麦胚芽添加比例对蜂群群势增长的影响

如表4所示，各时间点均是D组蜂群群势增长最快。12 d时，D组蜂群群势增长显著高于B、C、E组；24 d时，D组蜂群群势增长显著高于其他各组；36 d时，D组蜂群群势增长显著高于E组。

2.3 不同小麦胚芽添加比例对工蜂初生重的影响

由图1可知，C组工蜂初生重最大，B组工蜂初生重最小，二者差异显著。当饲料中小麦胚芽添加量超过45%时，工蜂初生重呈现降低的趋势。A、D、E组之间无显著差异。

2.4 不同小麦胚芽添加比例对工蜂中肠组织发育状态的影响

分别在40×和200×放大倍数下对工蜂中肠组织结构进行观察，图中黑色线段表示肠壁厚度，蓝色线段表示隐窝深度（图2）。由图3可知，随着小麦胚芽添加水平的提高，14日龄工蜂中肠肠壁厚度和隐窝深度的变化趋势基本一致，呈现先升高后降低的趋势。C组中肠肠壁厚度与隐窝深度均最大，且均显著高于A、D、E组，与B组差异不显著。

2.5 不同小麦胚芽添加比例对工蜂消化能力的影响

如表5所示，小麦胚芽的添加比例对14日龄工蜂中肠蛋白酶活性有显著影响。工蜂中肠蛋白酶活性随代花粉饲料中小麦胚芽添加比例的升高呈现先升高后降低的趋势，以D组蛋白酶活性最高，显著高于B、E组，与A、C无显著差异。代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例对14日龄工蜂中肠淀粉酶与蔗糖酶活性无显著影响。

2.6 不同小麦胚芽添加比例对抗氧化相关基因相对表达量的影响

由表6可知，1日龄时，小麦胚芽的添加比例对工蜂SOD1基因的相对表达量无显著影响（P>0.05）；SOD2基因的表达量E组最高，B组最低，CAT基因的表达量出现下降趋势。14日龄时，小麦胚芽的添加比例对工蜂SOD1基因的相对表達量无显著影响（P>0.05）；随着小麦胚芽添加水平的提高，SOD2基因的表达量B组最高，D组最低，CAT基因的表达量逐步下降，且D、E组表达量显著低于A组。

3 讨论

3.1 代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例影响蜂群采食量

研究表明，蜜蜂在春繁时期对饲粮中粗蛋白的需求水平约为25%[2]。本试验通过改变小麦胚芽代替花粉的水平来探究小麦胚芽对蜜蜂春繁的影响，结果显示，随着小麦胚芽添加比例的提高，蜂群采食量呈现降低的趋势，这与Herbert等[18]的研究结果一致。推测可能因为小麦胚芽适口性不高，代用花粉比自然花粉对蜜蜂的吸引力低[19，20]，影响蜜蜂采食。蜜蜂的采食量受各种因素的影响，包括饲料的适口性、能量水平、蛋白质水平和环境、饲喂技术、蜜蜂自身[21]。

3.2 代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例影响蜂群群势的增长

Van Engelsdorp[22]与Mattila[23]等的研究发现，蜂群的群势受环境、营养状况等因素的影响，在春繁阶段饲喂花粉或代花粉饲料的蜂群要比不饲喂的蜂群能培育出数量更多的工蜂。李肖[15]研究发现，不同的代花粉饲料中，玉米蛋白粉、膨化豆粕和发酵豆粕对春繁阶段意大利蜜蜂群势影响不显著，与本试验结果不一致，可能由于不同蛋白源对意大利蜜蜂蜂群群势的作用效果不同。本试验中随着小麦胚芽添加水平的提高，对蜂群群势的增长有显著影响，饲喂蜂群含65.00%小麦胚芽的代花粉饲料，可促进蜂群发展，而添加过高比例的小麦胚芽则不利于蜂群繁殖。这可能是因为添加比例过高致使蜂群采食量过低，无法满足繁殖需要的蛋白质水平。

3.3 代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例影响工蜂的初生重

工蜂初生重是衡量蜜蜂个体质量的重要指标[24，25]。在蜂群中，工蜂初生重也是对幼虫期营养吸收及发育状况的反映。研究表明，蜂体的大小可反映出蜂群食物的蛋白质水平[25，26]。本试验中，在饲料中添加45.00%的小麦胚芽可以明显提高工蜂的初生重，说明小麦胚芽可以在一定程度上改善饲料的质量。当小麦胚芽含量过高时，工蜂初生重呈现降低趋势，这可能与小麦胚芽含量过高致使采食量降低无法满足蜂群对蛋白质的需求有关。

3.4 代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例影响工蜂中肠组织发育状态

蜜蜂的中肠分泌消化酶，是消化食物和吸收养分的主要部位[27]。蜜蜂中肠的中段为吸收区域，后端有规律的分泌消化酶。中肠内部有凹陷的褶皱可以增加其吸收面积，中肠中的围食膜既可以保护中肠免受食物颗粒和病原微生物的损害又可以对中肠进行区室化作用，促进食物的消化吸收。研究表明，饲喂蜂蜜蔗糖越冬饲料对中肠肠壁厚度与隐窝深度的促进作用要优于饲喂果葡糖浆，说明蜜蜂饲粮会影响中肠的发育状态[28]。本试验结果显示，代花粉饲料中添加45.00%小麦胚芽时，工蜂的中肠厚度和隐窝深度最大，表明添加适量的小麦胚芽对蜜蜂肠道具有保护作用，可促进蜜蜂肠道发育。

3.5 代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例影响工蜂消化能力

花粉或代花粉饲料能够为蜂群繁育提供蛋白质、脂肪和糖等营养物质，这些营养物质被不同的消化酶消化分解为可被肠道吸收的小分子物质。消化酶主要由蜜蜂中肠分泌[29]，主要包括蛋白酶、蔗糖酶和淀粉酶。本试验中，蛋白酶活性在小麦胚芽添加量达到65.00%时呈现最高值，添加过量的小麦胚芽则会使中肠蛋白酶活性降低。推测过高水平的小麦胚芽导致采食量下降，表明其消化率不高，蜜蜂对小麦胚芽的消化能力差，影响蛋白酶活性，其机理有待进一步探究。不同添加比例的小麦胚芽对淀粉酶和蔗糖酶活性则没有影响，可能由于小麦胚芽作为一种蛋白质饲料对碳水化合物分解酶类影响不大。

3.6 代花粉饲料中小麦胚芽的添加比例影响工蜂抗氧化基因相对表达量

在蜜蜂体内存在一系列的抗氧化酶，其中最主要的有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化氢酶（catalase， CAT）等[30]，在保护细胞内容物免受自由基的破坏中起着至关重要的作用。本试验对1日龄和14日龄工蜂SOD1、SOD2以及CAT基因的表达量进行测定，结果表明，饲粮中添加不同比例的小麦胚芽对两种日龄工蜂的SOD1基因均没有显著影响；随着添加水平提高，SOD2、CAT基因的表达量表现出下降趋势。这说明小麦胚芽在提高工蜂的抗氧化能力上面，其作用低于花粉，但对于基因和蛋白的表达是否同步，现在尚不清楚，这也是我们下一步研究的重点。

4 结论

代花粉饲料中小麦胚芽添加比例在45.00%～65.00%时，可以促进蜂群群势的增长、提高工蜂初生重、促进中肠发育、提高中肠蛋白酶活性，但会下调SOD2与CAT基因的表达。建议在生产实践中，代花粉饲料中可添加适当比例的小麦胚芽。

参 考 文 献：

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