大白菜品种资源抗根肿病鉴定

张淑霞 张清霞 司朝光 王媛 杨征 杨晓云

摘要：为了解大白菜抗根肿病品种的抗性表现及为育种利用提供依据，本研究对国内外抗根肿病大白菜品种资源进行根肿病人工接种鉴定和分子标记鉴定。结果表明：94份接种青岛根肿病菌的鉴定品种中有74.46%为抗病品种，其中表现免疫或高抗的占鉴定品种的65.95%；65份接种2012年双龙根肿病菌的品种中12份表现抗病，占18.46%，其中表现高抗的有5份，占鉴定品种的7.69%；50份接种2013年双龙根肿菌的品种中表现抗病的仅有2份，占鉴定品种的4%； KBrH129J18R分子标记鉴定的86份品种中有56份出现抗病特征条带，占鑒定品种的65.12%，抗青岛根肿病菌的品种分子标记中大都有抗病条带出现。

关键词：大白菜品种；根肿病；人工接种鉴定；分子标记鉴定

中图分类号：S634.103.7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0098-05

Abstract The clubroot resistance（CR）of Chinese cabbage varieties from home and abroad were identified by inoculation and molecular marker methods in order to know about their resisctance performance and breeding utilization. The results showed that 74.46% varieties showed resistance to Qingdao isolates of Plasmodiophora brassicae， in which immune or highly resistant varieties accounted for 65.59%. There were 18.46% varieties showing resistance to Shuanglong isolates collected in 2012， in which highly resistant varieties accounted for 7.69%. And only 4% varieties showed resistance to Shuanglong isolates which collected in 2013. Of the 86 varieties identified by KBrH129J18R molecular marker， the resistant bands were found in 56 varieties which accounted for 65.12%， and appeared in most of the varities which resistant to Qingdao isolates.

Keywords Chinese cabbage variety； Clubroot； Inoculation identification； Molecular marker identification

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染而引起的一种世界性土传病害，在我国大部分地区均有发生，且日益严重，已成为大白菜的主要病害。选用抗病品种是对该病的根本防治方法。根肿病菌存在着生理小种分化，全世界已鉴定出生理小种24个以上[1]，我国报道的各地生理小种以4号为主，其他的还有2号、7号、10号、11号、13号生理小种[2-4]。抗根肿病基因位点也较多，目前已有8个抗病基因被报道 [5-11]。因此选用和选育抗病品种首先要明确抗病品种和抗源材料对不同生理小种或不同地区根肿病菌的抗性，而利用分子标记能快速鉴定品种资源抗根肿病性状。本研究在广泛引进国内外抗根肿病大白菜品种的基础上，进行不同地区根肿病菌的抗病性接种鉴定和分子标记鉴定，旨在了解大白菜抗根肿病品种的抗性表现，以期为大白菜抗病育种的利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大白菜品种为源于国内外的95份抗根肿病大白菜品种，其详细信息见表1，青研春白一号（CK1）、87-114（CK2）为感病对照品种（青岛市农业科学研究院提供）。供试大白菜根肿病菌分别来源于青岛市农业科学院大白菜87-114的根肿病肿块（青岛根肿病菌）、2012年采自云南昆明市盘龙区双龙乡的大白菜根肿病肿块（2012年双龙根肿病菌）、2013年采自云南昆明市盘龙区双龙乡的大白菜根肿病肿块（2013年双龙根肿病菌）。

1.2 人工接种鉴定方法

采用注射法对2012—2016年引进的95份抗根肿病大白菜品种或试种样品及感病对照品种进行人工接种鉴定，72孔穴盘播种并接菌，接种孢子浓度为2×108个/mL，接种量为每穴1 mL[12]。

根据病情指数划分抗性评价标准：免疫（I）：病情指数为0；高抗（HR）：0<病情指数≤11.11%；抗病（R）：11.11%<病情指数≤33.33%；感病（S）：33.33%<病情指数≤55.55%；高感（HS）：病情指数>55.55%。

1.3 分子标记鉴定方法

对95份抗根肿病大白菜品种中的86份及2份感病对照进行分子标记鉴定，采用本课题组经多次验证结果稳定的大白菜抗根肿病基因CRb的分子标记KBrH129J18R。用改良CTAB法提取所用材料的全基因组DNA。提取到的基因组总DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND-1000超微量核酸蛋白测定仪测定DNA纯度和浓度。PCR混合物反应体积为10 μL，扩增体系包括2 mmol·L-1的dNTP 0.2 μL，10×PCR Buffer 1 μL，25 mmol·L-1的MgCl2 1 μL，5 U·μL-1的TaqDNA聚合酶0.1 μL，100 mmol·μL-1的引物（上海生工）各0.05 μL，10 ng·μL-1的DNA模板3 μL，不足部分用ddH2O水补足。采用ABI Veriti梯度PCR仪进行扩增。扩增程序为94℃2 min→（94℃ 30 s→55℃ 30 s→68℃ 30 s）35个循环→68℃ 5 min。PCR产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶恒功率电泳1.0～1.5 h，采用简易银染法染色，显影，借助灯箱读带，然后拍照并存档。

2 结果与分析

2.1 人工接种鉴定结果

由表2可知，不同来源病菌对各品种的致病性不同，2013年双龙根肿病菌致病力最强。用2013年双龙根肿病菌鉴定的50份品种中只有金锦（编号为28） 和T1-07S（编号为71） 表现抗病，TI-11W（编号为73） 和CR-1（编号为85） 表现为感病，其他46份品种全部表现高感。65份接种2012年双龙根肿病菌的品种中有12份表现抗病或高抗，占鉴定品种的18.46%，其中高抗品种5份，占鉴定品种的7.69%；94份接种青岛根肿菌的品种中有70份表现抗病、高抗或免疫，占鉴定品种的74.46%，其中表现免疫或高抗的品种62个，占鉴定品种的65.95%，占抗病品种的88.57%。70份抗青岛根肿病菌品种中只有LS-大白菜（编号为13）、金锦（编号为28）、利民（编号为30）和10070（CR）（编号为56）4个品种对2012年双龙根肿病菌也表现高抗，其他大部分品种对其表现感病。而编号为1～25的大白菜对青岛根肿病菌表现感病的品种中则有多个品种对2012年双龙根肿病菌表现抗病。

2.2 分子标记鉴定结果

2012 —2016年共计对上述95份接种鉴定品种中的86份进行KBrH129J18R分子标记鉴定，结果详见表3，引物KBrH129J18R在部分品种中的扩增结果见图1。86份分子标记鉴定品种中出现抗病条带的有56份，占鉴定品种的65.12%，70份抗青岛根肿病菌的品种分子标记中大都有抗病条带出现，表明大部分抗青岛根肿病菌的品种具有CRb基因；而编号为1～25大白菜品种（除19号品种外）对青岛根肿病菌多表现为感病则没有扩增出抗病条带，接种鉴定与分子标记鉴定结果基本吻合，因此对筛选具有CRb基因的抗病材料可以用KBrH129J18R等分子标记直接鉴定筛选。编号为19、27、47、78、79共5份大白菜品种的分子标记鉴定结果与人工接种鉴定结果不一致，还需要重复验证。

3 小结

3个不同来源的根肿病菌致病力明显不同，2013年双龙根肿病菌致病力最强，抗源极少。2012年双龙根肿病菌和2013年双龙根肿病菌致病力的差异，也表明抗病品种的种植会导致根肿病生理小种分化致病力增强。

本研究结果表明目前我国的抗根肿病大白菜品种资源多数具有CRb抗病基因，与接种鉴定结果结合分析，发现同是具有CRb抗病条带，28号、30号、56号品种不仅抗青岛根肿病菌同时抗双龙根肿病菌，表明这些品种应该还具有其他抗病基因位点，是抗病育种的优良抗源材料。

参 考 文 献：

[1] 孙保亚，沈向群，郭海峰，等.十字花科植物根肿病及抗病育种研究进展[J].中国蔬菜，2005（4）：34-37.

[2] 沈向群，聂凯，吴琼，等.大白菜根肿病主要生理小种种群分化鉴定初报[J].中国蔬菜，2009（8）：59-62.

[3] 丁云花，简元才，余阳俊，等.我国8省市十字花科蔬菜根肿病菌生理小种的鉴定[J].中国蔬菜，2013（16）：85-88.

[4] 季海雯，任莉，陈坤荣，等.油菜根肿病病原主要生理小种和品种抗病性鉴定[J].中国油料作物学报，2013，35（3）：301-306.

[5] Matsumoto E， Yasui C， Ohi M， et al. Linkage analysis of RFLP makers for clubroot resistance and pigmentation in Chinese cabbage（Brassica rapa ssp. pekinensis）[J]. Euphytica，1998，104：79-96.

[6] Piao Z Y， Deng Y Q， Choi S R， et al. SCAR and CAPS mapping of CRb， a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2004， 108（8）：1458-1465.

[7] Suwabe K， Tsukazali H， Iketani H， et al. Identification of two loci for resistance to clubroot （Plasmodiophora brassicae Woronin） in Brassica rapa L[J]. Theor. Appl. Genet.， 2003，107（6）：997-1002.

[8] Suwabe K， Tsukazaki H， Ikatani H， et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana： the genetic origin of clubroot resistance[J]. Genetics， 2006，173： 309-319.

[9] Hirai M， Harada T， Kubo N， et al. A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage makers [J] Theor. Appl. Genet.， 2004，108： 639-643.

[10]Saito M， Kubo N， Matsumoto S， et al. Fine mapping of the clubroot resistance gene， Crr3， in Brassica rapa[J].Theoretical and Applied Genetics，2006，114（1）： 81-91.

[11]Sakamoto K， Saito A， Hayashida N， et al. Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）[J].Theor. Appl. Genet.，2008，117：759-767.

[12]張淑霞，杨晓云，司朝光，等.大白菜根肿病人工接种鉴定方法比较[J].山东农业科学，2010（1）：78-79.