半枝莲提取物对小鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎的治疗作用

彭勇，龚琼瑶，邹荣鑫，黄海燕，应颖，耿保庆，陈勇

半枝莲为唇形科黄芩属植物，具有抗炎症、免疫调节、解热、抗肿瘤、抗菌及抗氧化等药理作用[1]。半枝莲提取物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[2]，还具有抗炎症及免疫调节的作用[3]。类风湿关节炎（RA）系一种以关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病。活化的RA成纤维样滑膜细胞（FLS）在RA炎症的发生和发展过程中起着至关重要的作用，其具有异常增殖、迁移和浸润等类似肿瘤细胞样的生物学特性[4]。此外，RA患者的血清和炎症关节中存在着大量的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1 ）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-33（IL-33）等，这些炎症因子参与RA关节炎症反应及关节破坏的进程。因此，本研究通过研究半枝莲提取物对CIA小鼠模型关节炎症状况、关节组织病理学变化情况及血清细胞因子的表达水平等指标的影响，探讨其对RA小鼠的治疗作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物 SPF级近交系DBA/1小鼠，6～8周龄，雄性，体质量18～20 g，购自于上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK(沪)2012-0002，合格证编号：2007000564939]，于宁波大学医学院SPF级动物实验房饲养。本实验严格遵守单位机构动物伦理学委员会的伦理学指南进行。

1.2 实验材料 半枝莲提取物购自南京泽朗医药科技有限公司，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（FA）均为sigma公司产品，牛Ⅱ型胶原蛋白（CII）为Chondrex公司产品，ELISA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司。

1.3 构建RADBA/1小鼠模型及分组订购100只SPF级DBA/1小鼠，SPF级饲养1周，让小鼠熟悉环境；对小鼠进行编号，并随机分为5组：完全对照组、0.9%氯化钠注射液对照组以及半枝莲低、中、高剂量治疗组，每组20只。完全对照组不作任何处理。其他组小鼠建立CIA模型：将2 mg/ml CII与1 mg/ml CFA等体积在冰浴中混合、乳化。于每只小鼠尾根部皮下注射150 l该乳化剂进行造模，并记为造模第0天。造模第21天，将CII与CFA等体积混合、乳化，再次将该乳化剂150 l注射于小鼠尾根部皮下，强免疫1次。

1.4 给药观察 造模第22天开始造模小鼠灌胃给药：半枝莲低、中、高剂量治疗组分别通过灌胃给予半枝莲提取物30、60、90mg/次（用 0.9%氯化钠注射液配制），0.9%氯化钠注射液对照组及完全对照组，同步0.9%氯化钠注射液灌胃。每天1次，连续21 d。分别于造模第28和49天进行小鼠关节炎症状况评价：前后抓足掌厚度测定和关节炎评分两方面。关节炎评分标准：正常为0分；轻微的但有明确的发红和腕关节或踝关节发炎为1分；中等程度的发红和腕关节或踝关节发炎为2分；整个爪子包括脚趾严重的发红发炎记为3分：涉及多关节，四肢的最大程度的红肿、关节变形、功能损伤为4分[5]。四只爪子得分相加为小鼠关节炎总评分。

1.5 血清内细胞因子检测 造模第49天摘眼球取血1 ml，分离血清，检测各组小鼠血清IL-1 、IL-6、IL-33、TNF-和白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）的水平。

1.6 关节病理切片的制备 于造模第49天取小鼠左、右后肢，剔除皮毛及结缔组织，保留肌肉组织，浸泡在4%甲醛溶液中进行组织固定，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，病理分析，对于关节病理进行半定量评分。每个关节的半定量评分标准：0分，关节结构正常；1分，轻度的关节炎症并有滑膜增生，血管数量增加，以及小的炎症细胞灶，无软骨和骨的侵蚀破坏；2分，关节有软骨的侵蚀破坏，中度的关节炎症，大量的炎症细胞浸润，滑膜细胞增生、血管翳形成较严重，骨和关节结构无破坏；3分，有严重的血管翳形成，广泛的软骨侵蚀破坏，可见骨破坏，关节结构破坏[5]。两只后肢得分相加为小鼠关节病理总评分。

1.7 统计方法 采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-法；两组比较采用 检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIA小鼠关节炎模型的建立 在造模第14天首次观察到小鼠发病，第28天左右小鼠大规模发病，建模成功的CIA小鼠的足趾关节较对完全对照组小鼠的明显红肿。

2.2 小鼠关节炎症状况评价检测 造模第28天，4组造模组小鼠的足掌厚度明显高于完全对照组（均＜ 0.05），各造模组小鼠的足掌厚度差异无统计学意义（＞0.05）。造模第49天，4组造模组小鼠的足掌厚度明显高于完全对照组（均＜0.05），中、高剂量半枝莲治疗组小鼠的足掌厚度低于 0.9%氯化钠注射液对照组（均＜0.05）。见表1。造模第28天，4组造模组小鼠的关节炎评分差异无统计学意义（＞0.05）；造模第49天，中、高剂量半枝莲治疗组小鼠的节炎评分低于0.9%氯化钠注射液对照组及半枝莲低剂量治疗组（均＜ 0.05）。见表 2。

2.3 血清内细胞因子检测 造模第49天，0.9%氯化钠注射液对照组小鼠血清中炎症因子IL-1 、IL-6、IL-33、TNF- 及抑炎因子 IL-1Ra的水平均高于完全对照组小鼠（均＜0.05)。半枝莲低剂量治疗组小鼠血清中炎症因子IL-1、IL-6及IL-33的表达水平与0.9%氯化钠注射液对照组差异均无统计学意义（均＞0.05），TNF-水平低于0.9%氯化钠注射液对照组（＜0.05），IL-1R 高于0.9%氯化钠注射液对照组（＜0.05)。半枝莲中、高剂量治疗组小鼠血清中炎症因子IL-1 、IL-6、IL-33、TNF- 表达水平均低于0.9%氯化钠注射液对照组（均＜0.05），半枝莲高剂量治疗组低于半枝莲中剂量治疗组（均＜0.05）。半枝莲低、中、高剂量治疗组小鼠血清中抑炎因子IL-1Ra的水平均高于完全对照组及0.9%氯化钠注射液对照组（均＜0.05）。见表3。

2.4 病理结果分析 完全对照组小鼠关节结构正常（封三彩图8A），病理评分为0分。0.9%氯化钠注射液对照组小鼠关节呈现典型RA表现，可见大量滑膜细胞增生、炎性细胞浸润及血管翳形成，见广泛的软骨和骨侵蚀破坏，关节正常生理结构消失，关节面融合（封三彩图8 B）。半枝莲提取物低剂量治疗组与0.9%氯化钠注射液对照组仅关节间隙有所改善（封三彩图8C），病理评分与0.9%氯化钠注射液对照组差异无统计学意义（＞0.05）。半枝莲提取物中剂量治疗组小鼠关节间隙仍有狭窄，可见大量的炎症细胞浸润，滑膜细胞增生、血管翳形成较严重，可见软骨的侵蚀破坏，但骨和关节结构存在（封三彩图8D），病理评分较0.9%氯化钠注射液对照组改善（＜0.05）。半枝莲提取物高剂量治疗组小鼠关节腔结构基本正常，未见明显骨质破坏及血管翳形成，可见轻度炎性细胞浸润、滑膜增生，仅部分关节可见软骨轻微侵蚀破坏（封三彩图8E），病理评分较0.9%氯化钠注射液对照组改善（＜0.05）。见表 4。

表1 各组小鼠足掌厚度比较 cm

表2 各组小鼠关节炎评分比较 分

表3 各组小鼠血清中细胞因子检测结果比较 pg/ml

3 讨论

RA是一种由多种免疫细胞参与的全身性自身免疫性疾病，最终将导致关节软骨和骨的破坏。目前对于RA发病机制并不十分清楚，其基本病理表现为滑膜炎，FLS在RA的滑膜异常增生及骨侵蚀中起着关键性作用[6]。FLS类似肿瘤细胞样的生物学特性表现为异常增殖、迁移和浸润及抗凋亡[7]；此外，还有调节炎性因子分泌的作用，如调节TNF-、IL-1、IL-6和IL-13等细胞因子[8]。这些炎症因子是 RA 发病机制中重要的炎性因子[9]。IL-1Ra与IL-1受体结合后抑制IL-1信号复合物的形成，是一个重要的负性调节[10]，在RA中起到一定程度的保护作用。

半枝莲及其提取物均具有良好的抗肿瘤活性且疗效确切。Jiang等[11]研究发现，半枝莲可以通过下调IL-6表达水平，抑制人结肠癌细胞的STAT3信号通路，最终抑制人结肠癌细胞的异常增殖并促进其凋亡，达到抗肿瘤作用。在肺癌小鼠实验中发现，半枝莲可显著抑制荷瘤小鼠血清中IL-17、IL-10和IL-6表达水平，上调IL-2和干扰素-（IFN-）水平，并通过调节荷瘤小鼠的免疫功能而抑制体内肿瘤生长[12]。此外，有研究还发现，给予半枝莲治疗的糖尿病小鼠，其视网膜中TNF-和IL-1的mRNA表达水平及血清中TNF-和IL-1表达水平均受到显著抑制，半枝莲通过预防糖尿病小鼠的视网膜炎症进而防止糖尿病视网膜病变[13]。本研究发现，中、高剂量半枝莲提取物可有效减轻 CIA小鼠关节肿胀程度，有效改善小鼠关节炎评分，并呈现剂量依赖性。同时还发现半枝莲提取物可显著抑制 CIA小鼠血清中炎症因子IL-1、IL-6、IL-33、TNF-的表达水平，同时上调了炎症负性调节IL-1Ra表达水平，同样呈现了剂量依赖性。本研究还发现：中、高剂量半枝莲提取物可降低CIA小鼠关节病理评分，可有效减轻CIA小鼠关节滑膜细胞增生、炎性细胞浸润及血管翳形成，延缓关节软骨和骨侵蚀破坏，保护小鼠关节正常生理结构，总体改善CIA小鼠关节病理情况，与关节炎评价中足掌厚度结果、关节炎评分结果一致。

综上所述，半枝莲提取物可有效地减轻CIA小鼠关节炎症，改善CIA小鼠关节病理情况，对RA小鼠具有治疗作用，其作用机制可能是通过抑制IL-1、IL-6、IL-33、TNF- 等炎症因子表达，并上调抑炎因子IL-1Ra的水平来实现的。但本文也仅初步探讨研究了半枝莲提取物对CIA小鼠的治疗作用，其具体作用机制尚不清楚，这有待进一步研究。

表4 各组小鼠关节病理评分结果比较 分