一枝黄花的提取工艺研究

毛艳峰 康兴东 刘九平 杨伟庆 梁 佳

（江西普正制药有限公司，江西吉安331409）

0 引言

一枝黄花是菊科一枝黄花属植物一枝黄花（Solidago decurrens Lour.）的干燥全草，主产于长江以南各地[1]。一枝黄花的化学成分包括黄酮、皂苷、苯甲酸苄酯、当归酸桂皮酯、炔属化合物、苯丙酸等[2]。在2015年版《中华人民共和国药典》一部中，一枝黄花是以芦丁作为其指标性成分进行定量考察的[3]。本文采用正交试验法，结合单因素考察，以有效成分芦丁作为指标，对一枝黄花的提取工艺进行了优化研究，为一枝黄花生产工艺的确定提供了依据。

1 实验材料

1.1 药材

一枝黄花药材购自贵州遵义，经江西普正制药有限公司质量管理部检测为一枝黄花。

1.2 仪器

高效液相色谱仪：Waters1525型高效液相色谱仪；色谱柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm）；JK-100型超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-5203A型旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司）；HHS-24型电热恒温水浴锅（上海东星建材实验设备有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海雅荣生化设备仪器有限公司）。

1.3 试剂

乙腈、甲醇为色谱纯，超纯水，其余试剂为分析纯。

2 提取方法

选择乙醇回流提取法和水煎煮法对一枝黄花药材进行提取，结合HPLC法测定芦丁含量，对其提取工艺进行初步研究。

2.1 乙醇回流提取法

2.1.1 60%乙醇回流提取

称取一枝黄花药材10 g，用60%乙醇（V/V）回流提取2次，每次加入60%乙醇10倍量，第一次提取3 h，第二次提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100mL，再取2mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

2.1.2 70%乙醇回流提取

称取一枝黄花药材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取2次，每次加入70%乙醇10倍量，第一次提取3 h，第二次提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100mL，再取2mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

2.1.3 80%乙醇回流提取

称取一枝黄花药材10 g，用80%乙醇（V/V）回流提取2次，每次加入80%乙醇10倍量，第一次提取3 h，第二次提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100mL，再取2mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

2.2 水煎煮法

称取一枝黄花药材10 g，用水煎煮2次，每次加水10倍量，第一次煎煮3 h，第二次煎煮2 h，滤过，合并滤液，浓缩后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

2.3 合格标准

2.3.1 检测方法

按照《药典》四部通则0512规定的高效液相色谱法测定一枝黄花中的芦丁含量。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.4%醋酸溶液（16∶8∶76）为流动相；检测波长为360 nm。理论板数按芦丁峰计算应不低于2 500。

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，加热回流40 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3.2 合格标准

本品按干燥品计算，含无水芦丁（C27H30O16）不得少于0.10%，即1 mg/g。

2.4 结果

采用上述提取方法所得一枝黄花提取液中的芦丁含量如表1所示。

从表1可知：采用乙醇回流提取法和水煎煮法所提取的无水芦丁含量相差较多。水煎煮法的无水芦丁得率约为乙醇回流提取法的1/10～1/8。而采用60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇回流提取的无水芦丁含量差别不大。

3 提取正交试验

通过上述对不同提取方法的考察，本文选择了乙醇回流提取法对一枝黄花进行提取，并继续通过采用正交试验法对乙醇回流提取法的工艺参数进行考察。

3.1 因素水平的确定

正交试验以芦丁得率为指标，对乙醇浓度（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）四个参数进行考察，因素水平表如表2所示。

按照L9（34）正交设计表进行9组试验。由于没有空白因素列，因此每组试验重复进行3次，共进行27次试验，根据每次试验的误差与整体试验的误差，检验该正交试验的可行性。

表1 提取液中芦丁含量

表2 因素水平表

3.2 正交试验方法

3.2.1 试验一

称取一枝黄花药材10 g，用50%乙醇（V/V）回流提取1次，加入50%乙醇6倍量，提取1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.2 试验二

称取一枝黄花药材10 g，用50%乙醇（V/V）回流提取2次，加入50%乙醇8倍量，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.3 试验三

称取一枝黄花药材10 g，用50%乙醇（V/V）回流提取3次，加入50%乙醇10倍量，每次提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.4 试验四

称取一枝黄花药材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取3次，加入70%乙醇6倍量，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.5 试验五

称取一枝黄花药材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取1次，加入70%乙醇8倍量，提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.6 试验六

称取一枝黄花药材10 g，用70%乙醇（V/V）回流提取2次，加入70%乙醇10倍量，每次提取1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.7 试验七

称取一枝黄花药材10 g，用90%乙醇（V/V）回流提取2次，加入70%乙醇6倍量，每次提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.8 试验八

称取一枝黄花药材10 g，用90%乙醇（V/V）回流提取3次，加入70%乙醇8倍量，每次提取1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.2.9 试验九

称取一枝黄花药材10 g，用90%乙醇（V/V）回流提取1次，加入70%乙醇10倍量，提取1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至100 mL，再取2 mL用70%乙醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

3.3 正交试验结果

按照L9（34）正交试验表进行试验，每个因素水平试验3次，结果如表3所示，方差分析如表4所示。

3.4 正交试验结果分析

（1）提取一枝黄花时，A、B、C、D四个因素均具有极显著性差异，这些影响因素按序排列为D＞A＞C＞B，即提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析

（2）直观分析正交试验结果可以看出，提取效率最高的工艺参数组合为A2B1C2D3，即70%乙醇6倍量、每次提取1.5 h、提取3次，芦丁平均提取效率为12.72 mg/g。

（3）经方差分析可知，最佳提取工艺参数为A2B3C2D3，即70%乙醇10倍量、每次提取1.5 h、提取3次，具体相关提取效率需经过中试验证确认。

4 正交试验的工艺验证

4.1 中试工艺验证

综合正交试验结果分析和实际提取成本两方面进行考虑，对最佳提取工艺和提取效率最高的工艺进行中试提取验证，提取条件为：称取一枝黄花药材100 g，用70%乙醇（V/V）10倍量回流提取3次，每次提取1.5 h，滤过，合并滤液，回收乙醇后加水定容至1 000 mL，再取20 mL用70%乙醇定容至100 mL，即得供试品溶液，取样进行芦丁含量检查。连续进行3次中试工艺验证，以检查其工艺的重现性。

4.2 检验方法

按照《药典》四部通则0512规定的高效液相色谱法测定一枝黄花中的芦丁含量。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.4%醋酸溶液（16∶8∶76）为流动相；检测波长为360 nm。理论板数按芦丁峰计算应不低于2 500。

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，加热回流40 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.3 合格标准

本品按干燥品计算，含无水芦丁（C27H30O16）不得少于0.10%，即1 mg/g。

4.4 验证结果

正交试验验证结果如表5所示。

表5 正交试验验证结果

验证结果显示：按最佳提取工艺参数，即70%乙醇10倍量回流提取3次，每次提取1.5 h，经连续3次试验验证，无水芦丁（C27H30O16）含量均符合标准要求。

5 结语

本文通过采用HPLC法测定芦丁含量后发现，在相同的实验条件下，乙醇回流提取法和水煎煮法提取一枝黄花中的芦丁含量相差较多。水煎煮法的芦丁得率约为乙醇回流提取法的1/10～1/8；而采用60%～80%浓度乙醇提取一枝黄花所得的芦丁含量相差不多，因此选择乙醇回流法提取一枝黄花。

在一枝黄花的正交试验提取考察中，乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间四个因素均具有极显著性差异，这些影响因素按序排列为提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。

按最佳提取工艺参数，即70%乙醇10倍量、每次提取1.5 h、提取3次，经中试工艺验证发现，无水芦丁含量均符合标准要求，表明该提取工艺的重现性好，为一枝黄花提取工艺的确定提供了实验依据。