邻苯二甲酸酯高效降解菌的筛选及表征

杨 捷， 姚炎华， 尹大强， 叶秀云

(1． 福州大学 福建省海洋酶工程重点实验室， 福建 福州 350116; 2. 同济大学 长江水环境教育部重点实验室，上海 200092)

邻苯二甲酸酯类(phthalate esters ，PAEs)作为塑料添加剂和软化剂广泛用于塑料产品、皮革、建筑材料、个人护理产品、洗涤剂、油漆等产品中[1].PAEs的一般结构由一个苯环和两个侧链组成，不同的PAEs的区别在于侧链基团的不同.PAEs的种类繁多，包括具有简单侧链基团的邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)，和具有复杂侧链基团的邻苯二甲酸丁苄酯(benzyl butyl phthalate，BBP)、邻苯二甲酸二(2─乙基己)酯(di-2-ethylhexylPhthalate，DEHP).在塑料制品中，PAEs以氢键或范德华力与塑料连接，这种不牢固的化学键使PAEs较容易从塑料中释放出来，造成了对大气、水体、土壤的污染[2].PAEs已成为全球最普遍的有机污染物之一，多种PAEs在全球主要工业国的生态环境中都达到了普遍检出程度，其中DBP、DEHP、DMP最常被检测出[3]，浓度一般在mg·L-1级别.在增塑剂生产过程产生的污水属于高浓度有机污染废水，PAEs浓度高[4].

PAEs是一类具有类似于雌激素作用的内分泌干扰物，且对动物具有致畸性、致突变性、致癌性以及生殖毒性[5]，具有低浓度长期危害特征.其污染控制己受到全球性关注，美国环保局(EPA)、中国环境监测总站及欧盟都将DBP、BBP、DEHP、DEP等多种PAEs列为优先控制污染物[6].

PAEs很难降解，在自然环境中通过水解、光解的速率非常缓慢.处理PAEs 污染物的现有技术主要有吸附、光化学氧化、生物降解等.吸附法和光化学氧化法成本高，且容易造成二次污染.微生物降解是自然界中PAEs去除的主要方式，具有清洁经济的特点，得到科研人员的广泛关注[7].DBP作为最常用的PAEs，许多研究人员从环境中筛选DBP的降解菌.已报道的DBP降解菌普遍降解浓度较低，仅在mg·L-1水平，且降解其他(如长链)PAEs的效率不高[8-9]，因此有必要筛选出降解能力更强、降解条件和底物范围更广的DBP降解菌，以提高微生物在降解PAEs中的应用价值.

本研究从土壤中筛选到能够高效降解DBP的菌株，通过生理生化以及16S rDNA等将其鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)，并测试其底物范围及探究降解DBP的条件、降解动力学，可为PAEs的污染治理提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 材料

土样采自福建省福州市晋安区新店镇红庙岭垃圾综合处理场.试剂：DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸、三氯甲烷(均为分析纯)、甲醇(色谱纯/分析纯)均购自国药试剂有限公司 ；用水为超纯水 其余无机盐试剂均为分析纯.

基础无机盐培养基(mineral salt medium，MSM)(成分的单位：g·L-1)：K2HP045.8 g，KH2P044.5 g，(NH4)2S042.0 g，MgCl20.16 g，CaCl20.02 g，Na2MoO4·2H2O 0.002 4 g，FeCl30.001 8 g，MnCl2·2H2O 0.001 5 g，pH 7.0.121℃高压灭菌20 min.

底物培养基：液体培养基是在试管中加入甲醇溶解的DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸母液，水浴加热使甲醇蒸发，待甲醇完全蒸发后再加入MSM配制成所需浓度的各类底物液体培养基.DBP固体培养基是DBP液体培养基加2%的琼脂.121℃高压灭菌20 min.

1.2 降解菌的筛选

称取土样5 g于100 mL 含5%的DBP液体培养液中，采用10%、15%、20%的DBP浓度梯度压力法驯化，30 ℃，150 r·min-1振荡培养7 d，再转接2 mL菌液至下一浓度梯度的DBP液体培养基培养.20%的DBP的菌液进行梯度稀释104倍后涂布于DBP固体平板上，30 ℃有氧恒温培养，通过划线在DBP固体平板上反复纯化，重复多次，直至菌落形态单一.挑取单菌落，在LB(Luria-Bertani)培养基中富集培养.

1.3 降解菌的分子生物学鉴定

用细菌基因组脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(OMEGA公司)提取细菌的总DNA，以其为模板，用16S rDNA特异性引物27F与1492R，进行16S rDNA扩增.

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，委托上海英潍捷基生物技术有限公司测序.将测序结果与NCBI数据库中Blastn 程序进行序列同源性检索和比对，并通过MEGA7.0软件，构建系统发育进化树，分析确定该菌的分类地位.

1.4 PAEs的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定PAEs含量：将菌体与液体培养基8000 r·min-1离心3 min.用三氯甲烷分别对菌和液体进行两次萃取得到PAEs，待三氯甲烷挥发后，加入甲醇定容至5.0 mL.用孔径为0. 22 μm的有机相过滤器过滤后，用高效液相色谱仪(DGC-20A3R型，岛津公司)测定液体中PAEs的含量.

HPLC分析条件：色谱柱Agilent?ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)，柱温35℃，流动相甲醇与水体积比为90∶10，流速为0.5 mL·min-1，检测器波长为228 nm，进样量为20 μL.利用HPLC测定PAEs的残留量.

1.5 生长量的测定

取菌液1 mL，离心分离，用MSM重悬菌液，紫外分光光度计(T6系列，上海普析通用仪器有限责任公司)测OD600，即为菌株的生长量.

1.6 底物特异性

挑取在DBP固体培养基中生长良好的单菌落，置于LB液体培养基中30 ℃，175 r·min-1培养10 h.离心收集菌体、重悬，配制菌体浓度OD6000.1.无菌条件下，吸取菌液，接种量于4 mL，8种10 g·L-1液体底物(DBP、DEHP、DMP、BBP、DEP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸)培养基中，pH 7、30 ℃、150 r·min-1摇床培养5 d.紫外分光光度计测定生长量，高效液相色谱法分析8种底物的残留量.

1.7 DBP降解条件的优化

分别探究不同的DBP初始浓度、pH、温度、摇床转速及葡萄糖添加量在72 h内对菌生长和降解DBP的影响.所有实验数据均为三次平行实验的平均值，数据采用Excel软件进行分析，图中误差线为三次平行实验的标准差.

1.8 降解动力学

分别探究初始质量浓度为1、5、10、20、50 g·L-1的DBP，在最佳培养条件下，每隔8 h测定72 h内DBP的残留量，每个样品设置三组平行.用软件GraphPad Prism5.0(GraphPad Software, Inc, USA)拟合实验数据，构建降解动力学模型，得出B3降解DBP的半衰期和速率常数.直观体现出时间和PAEs残留量的关系以及降解速率的变化.进一步研究出B3的降解DBP的特性，完善微生物降解PAEs有机污染物的研究.一级动力学模型可用方程表示：Y=(Y0-rPla)·e-Kt+rPla，Y表示DBP的质量浓度,g·L-1;Y0为初始质量浓度，g·L-1；rPla为无限时间后DBP残留质量浓度，g·L-1；K为速率常数，半衰期t1/2= ln 2/K，初始降解速率v0= dY/dt=(Y0-rPla)·K·e-Kt，t→0.v0的单位为g·L-1·h-1.

2 结果与讨论

2.1 降解菌的鉴定

经过富集培养，分离得到一株能够在以DBP为唯一碳源的基础培养基中生长良好的菌，命名为B3.观察菌落形态并通过结晶紫简单染色观察细菌，发现菌落呈黄绿色不透明，中等大小，表面粘稠，边缘平整，规则圆形，表面隆起，细长杆状.

扩增得到B3的16S rDNA序列，并构建系统进化树(图1)，B3与寡养单胞菌(Stenotrophomonassp. KX928046.1)聚为一支，相似性为99%，同时结合该菌株的菌落形态特征，判定其为寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.).据报道，寡养单胞菌能降解甲基对硫磷[10]、双对氯苯基三氯乙烷(DDT)有机农药[11]和四环素[12]等有机污染物，本研究筛选得到的能降解PAEs的寡养单胞菌为首次发现.

图1 B3的系统发育树分析Fig.1 Phylogenetic analysis of strain B3

2.2 底物特异性

将B3分别接种于如表1所示的8种10 g·L-1底物液体培养基中，培养5 d后检测菌株的生物量(OD600)及底物的残留量，计算降解率.

B3在8种底物培养基中均能生长，其中在短链的PAEs(DBP 、BBP、DMP)以及苯胺中生长较好(OD600>0.8)，而在长链PAE(DEHP)中生长较慢，这种差异可能是由于各类PAEs侧链不同所引起的[8-9].B3对8种底物的降解率均在50%及以上，其中对BBP(90.1%)和苯胺(89.0%)的降解率最高，其次是DBP(75.9%)和DMP(73.0%).这表明B3的底物特异性不明显，能够降解多种PAEs及芳香类化合物.与B3类似，许多已报道的DBP降解菌更容易利用短链的PAEs，而对长链PAEs如DEHP的降解效果不佳：如Gordoniasp. strain QH-11[13-14]降解DEP和DBP的效果比长链的DMP、 DIOP、 DEHP的好；Camelimonassp. M11[15]降解DPP、DEP、DBP的效率依次递减.B3降解10 g·L-1的长链DEHP的能力虽不比短链的好，但降解率仍有60%以上.

2.3 降解条件优化

首先探究底物DBP的初始浓度对B3生长和降解率的影响(表2).表中，培养条件：pH为7，30 ℃，175 r·min-1，初始菌浓度OD600为0.05，反应时间为72 h.随着底物浓度增加，B3生长量在增长，当质量浓度大于10 g·L-1，呈缓慢下降趋势，表明B3对DBP具有很强的耐受性.DBP质量浓度为0.05 g·L-1时，降解率为93.4%，DBP浓度提高，降解率缓慢下降，可能是由于底物过剩，或是DBP本身具有毒性，随着其浓度增加对菌的抑制作用增强.当DBP质量浓度小于等于10 g·L-1时，B3降解DBP的效率均大于75%.当DBP质量浓度在20 g·L-1及以上时，降解率仍维持在70%左右.许多报道也研究了不同浓度DBP对菌的降解的影响：He[8]和Jin[13]等分别研究了0.6～1.2 g·L-1和0.1～0.75 g·L-1质量浓度范围的DBP对菌降解的影响.B3降解DBP浓度范围较前人的宽，而且效率高.表2中，生长量以OD600表示(下同).

表1 B3的底物特异性Tab.1 Substrate specificity of strainB3

表2 DBP初始浓度对B3菌株降解的影响Tab.2 Effect of initial DBP concentrations on the degradation efficiency by B3

在10 g·L-1DBP初始质量浓度下，探究pH、温度、摇床转速、接菌量和葡萄糖浓度对B3生长和降解DBP的影响(图2、表3).图2显示，B3的生长量和降解率呈现正相关.图2a显示，30 ℃条件下，B3在pH为5～11，B3对10 g·L-1DBP的降解率保持在60%以上，当pH由7上升至8时， B3的降解率由75.9%提高至92.2%，说明弱碱性的环境有利于B3对DBP的降解.Wu等[16]筛选出的Ochrobactrumsp. JDC-41在 pH小于5或pH高于9，DBP降解率骤降至2%～35%.而B3在pH小于6或高于9的条件下，对DBP的降解率都超过60%，表明B3降解DBP受pH影响相对较小.

在pH 8的条件下探究温度对B3降解DBP的影响(图2b).不同温度下菌株的生长量和降解率不同，这可能与菌体内酶的活性有关.20 ℃～45 ℃时，B3降解率均在60%以上，其中在25 ℃～35 ℃降解率大于80%，35 ℃时降解率最高，为94.1%.B3在温度40 ℃及以上时，对10 g·L-1DBP仍具有70%以上的降解率，这与报道的降解DBP的eBrucellaceae、Sinobacteraceae[7]等菌株不同，这些菌降解的最适温度均在30 ℃～35 ℃间，但温度大于40 ℃或低于25 ℃时，降解活力大大降低.

图2c摇床的转速反映了对B3降解DBP过程中的溶解氧的供给量，溶解氧供给量不足或是过量，好氧微生物的生长与代谢均会受影响.转速过低通气量不足，菌株的生长和降解效果不佳；随着转速提升，B3生长和降解速率增加，在转速175 r·min-1时B3菌株的生长量达到最高、降解DBP的效果最佳.转速高于175 r·min-1时，生长量和降解率均有所降低.Wu等[17]发现Gordoniasp.降解DBP的最佳摇床转速为175 r·min-1，而转速大于或小于175 r·min-1时，B3对DBP的降解效果降低，本文与该结果相似.与本文不同的是，Gordoniasp菌在75 r·min-1时，对0.4 g·L-1的DBP降解率只有20%左右，而B3在静置培养时，降解率仍有60%.

a pH

b 温度

c 转速

d 接菌量

葡萄糖质量浓度/(g·L-1)00.250.50.7511.251.5生长量1.5 ± 0.22.0 ± 0.12.6 ± 0.14.3 ± 0.15.2 ± 0.1 5.5 ± 0.15.9 ± 0.1降解率/%95.8 ± 0.5 62.1 ± 2.465.9 ± 0.994.2 ± 0.295.1 ± 0.195.8 ± 1.795.9 ± 1.8

注：培养条件：pH 8，35 ℃，175 r·min-1，DBP质量浓度为10 g·L-1，接菌量OD6000.05，反应时间为72 h

由图2d可知接菌量OD600小于0.125时，降解率和B3的生长量上升显著，当接菌量OD600大于0.25时，降解率和生长量提高不明显.接菌量OD600为0.05至0.25时，B3菌对10 g·L-1的DBP的降解率超过94.3%.

探究葡萄糖添加量对B3降解的影响(表3)，发现葡萄糖添加量≤0. 5 g·L-1时，对B3降解DBP有抑制作用.葡萄糖对于许多微生物而言是良好的碳源，微生物在含葡萄糖的条件下为了优先利用葡萄糖，会抑制其他碳源的代谢[18].Jin 等[19]也探究了葡萄糖添加量对菌株降解DBP的影响，结果显示低浓度的葡萄糖抑制菌株对DBP的降解，这与本文结果相同.上述研究还表明高浓度的葡萄糖对菌降解DBP有促进作用，这与本文不同.因此得到结论，在B3降解DBP过程中没有必要添加葡萄糖.综上，B3降解10 g·L-1DBP的最佳pH为8，温度35 ℃, 培养转速为175 r·min-1，接菌量OD600为0.125，在72 h内降解效率可达95.8%.

2.4 DBP的降解动力学

在最佳培养条件下，设置DBP初始质量浓度为1、5、10、20、50 g·L-1，每隔8 h测定DBP的残留量，以GraphPad Prism5进行数据拟合(图3，表4)，探究B3菌对DBP的降解动力学.

图3 B3降解不同初始质量浓度DBP的降解曲线Fig.3 DBP degradation profiles at different DBP initial concentrations

实验结果表明，B3降解DBP符合一级动力学模型，降解速率与DBP初始浓度密切相关.初始浓度的增加，初始降解速率增大，当初始质量浓度为50 g·L-1时，初始降解速率可达1.25 g·L-1·h-1.DBP质量浓度小于等于10 g·L-1时，随DBP的浓度增大，半衰期缩短，降解速率常数增大；DBP质量浓度为10 g·L-1，降解速率常数达到最大(K=0.064)，半衰期最短(t1/2=10.8 h)；当DBP质量浓度为50 g·L-1时，半衰期增大，降解速率常数减小.一级动力学常用于有机污染物的降解动力学[20]，He等[9]报道的赤红球菌属(Rhodococcusruberstrain)，当DBP质量浓度小于等于0.8 g·L-1时，初始浓度的增加，降解速率增大，半衰期缩短；DBP质量浓度高于0.8 g·L-1时，随浓度增大，降解速率降低，半衰期增大，这些结果与本文结果相同.

表4 不同初始浓度DBP的降解动力学方程Tab.4 Degradation kinetics equation of DBP with different initial concentration

近年来，探寻绿色高效经济的降解PAEs的方法已成为研究热点，已有很多报道降解DBP的菌属(表5).许多研究报道的PAEs的降解率虽然可达90%，但降解的浓度通常在mg·L-1级别[21-22].Tang等[22]报道的根瘤菌(Rhizobiumsp.)降解50 mg·L-1的效率大于90%，而当浓度升高时，降解率大大降低，当DBP质量浓度为400 mg·L-1时，降解率仅为50%左右.而在Chen等[15]报道中Camelimonassp.在336h内降解0.03～0.14 g·L-1DBP的效率不高于56%.在有些DBP降解浓度较高的报道中，菌降解时间长、效率不高亦或需要多种菌的共同作用：Kumar等[14]报道的假单胞菌属(Pseudomonassp.)和丛毛单胞菌属(Comamonassp.)在192 h内分别降解2 g·L-1DBP的效率仅为57%、46%.本文筛选到的寡养单胞菌B3不仅在宽的浓度范围内保持着高效降解能力，而且降解的底物范围、温度、pH范围等条件均较宽.

表5 不同的DBP降解菌的降解特性Tab.5 Degradation characteristics of different PAEs by degrading bacteria

3 结论

本文筛选到的PAEs降解菌——寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)B3菌株，其对DBP的作用浓度和条件范围广.在30℃，pH 7条件下，B3在72 h内，对0.05～0.5 g·L-1DBP的降解率在86%以上，降解0.05 g·L-1DBP 的效率为93.4%.在35 ℃、pH 8 条件下，B3对1～50 g·L-1DBP的降解率在72%以上，初始降解速率高，当DBP质量浓度在5 g·L-1及以上时，降解率仍维持在80%左右，降解浓度高且高效降解浓度范围宽.在20 ℃～45 ℃的温度及pH 5～11的范围中，B3菌株对10 g·L-1DBP降解率保持在60%以上.在pH 8，35 ℃，175 r·min-1，接菌量OD600为0.125的条件下，对10 g·L-1DBP的降解在72 h内可达到95.8%.B3降解DBP符合一级动力学模型.B3不仅对DBP具有高效的降解效果，而且对DEHP、BBP、DEP、DMP、苯胺、甲苯和邻苯二甲酸的降解率均在50%及以上，其中对BBP、苯胺的降解效果在88%以上.B3菌宽的降解浓度和底物种类范围预示着该株寡养单胞菌在PAEs的生物修复中具有独特的应用价值.