INHA基因在公绵羊繁殖相关组织的表达研究

采复拉·大木拉 ，田志龙 ，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，乌鲁木齐 830000；3.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003）

抑制素（Inhibin，INH）是由绵羊卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌的糖蛋白质激素，由一个α亚基和一个β亚基通过二硫键构成，其中抑制素α亚基（Inhibin α，INHA）是抑制素发挥生理功能必不可少的。INHA基因主要在动物卵巢、睾丸中表达，后期研究者在动物肾脏、垂体、肌肉中检测到抑制素蛋白，其通过特异性抑制垂体促卵泡素分泌来调节卵泡的生成和抑制精子发生，从而降低睾丸的生精能力［1］。绵羊INHA基因已被定位到 2 号染色体上［2］。Shelling 等［3］的研究结果表明，INHA基因与女性卵巢早衰显著相关；刘晨等［4］研究发现，INHA基因5'UTR区的多态性对猪繁殖性状有显著影响。Jaeger 等［5］和 Hiendleder等［6］研究发现，INHA基因对绵羊产羔数有显著效应。目前，INHA基因在人、牛、羊、小鼠和大鼠等雌性中研究较多，但关于该基因在公绵羊繁殖相关组织中的研究鲜有报道。

小尾寒羊平均产羔率267%，是我国高繁殖性能绵羊品种之一；苏尼特羊是在自然选择与人工选育过程中形成的地方优良品种，平均产羔率113%［7］。本研究采用荧光定量PCR技术检测INHA基因在高繁殖力小尾寒羊公羊和低繁殖力苏尼特羊公羊下丘脑-垂体-睾丸轴等繁殖相关组织中的表达，以探索INHA基因与公绵羊繁殖生理功能之间的关系，为深入理解公绵羊繁殖机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和主要试剂

小尾寒羊来自山东省郓城县大鹏农牧科技有限公司，苏尼特羊来自内蒙古乌拉特中旗。从每个品种中分别挑选性成熟（8月龄以上）且健康状况良好的纯种公羊各3只。屠宰后分别采集大脑、小脑、下丘脑、垂体、输精管、肾上腺、睾丸和附睾等组织，立即置于液氮中暂时保存，样品带回实验室后全部转移至-80℃冰箱保存备用。

RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京），反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和荧光定量染料（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）均购于TaKaRa公司（大连）；2×Taq PCR Master Mix购于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 组织总RNA的提取和检测

采用动物组织总RNA提取试剂盒（天根，北京）加Trizol（Invitrogen，美国）提取各组织总RNA。使用Nano Drop2000检测提取RNA的纯度和浓度，并使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.3 引物设计

根据GenBank提供的绵羊INHA基因序列（登录号：NM_001308579.1），利用Primer Premier 5.0软件进行跨外显子引物设计，以RPL19（登录号：XM_015089125.1）作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物具体信息见表1。

表1 绵羊INHA和RPL19基因的引物信息

1.4 cDNA合成

利用反转录试剂盒合成cDNA，反转录体系总体积为20 μL，需要量组成见表2。反转录反应条件为：37℃15 min，85℃5 s，获得cDNA第一链。全程操作在冰上进行。使用内参基因RPL19对反转录cDNA进行PCR检测，将符合标准的cDNA置于-20℃保存，以用于检测目的基因的表达。

表2 反转录体系

1.5 PCR反应

PCR反应体系总体积为20 μL，需要量组成见表3。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35个循环；72℃延伸 5 min；4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。

表3 PCR体系 μL

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）

1.6.1 qPCR体系和程序 反应体系总体积为20 μL，需要量组成见表4。PCR程序为：95℃预变性5 s，95℃变性5 s，60℃30 s，40个循环；反应结束后对熔解曲线进行分析。

表4 实时荧光定量PCR体系 μL

1.6.2 实时荧光定量检测与数据分析 荧光定量检测利用Roche Light Cycler480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行，以RPL19为内参基因，每个样品重复检测3次。采用2-△△Ct法［8］计算目的基因的相对表达量，用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，用一般线性模型及最小显著差异（Least significant difference，LSD）法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取与cDNA合成

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行检测，结果表明，RNA完整性良好，28 S条带亮度大于18 S，且二者均无明显降解（图1A）；以反转录之后的cDNA为模板对INHA进行PCR扩增，设计的INHA引物扩增效果良好（图1B），目的片段与预期的一致，且条带单一，可以用于后续的荧光定量试验。

图1 8个组织RNA电泳检测及目的基因扩增

2.2 INHA基因在不同品种公羊繁殖相关组织中的表达

运用qPCR对小尾寒羊公羊和苏尼特羊公羊的8个繁殖相关组织中INHA基因的表达进行了研究，结果见图2。2个品种比较发现，INHA基因在2个绵羊品种中的表达呈现出组织特异性。其中，INHA基因在睾丸和肾上腺组织中高表达，在睾丸中表达量最高，其次是肾上腺、附睾，在其他组织中均呈痕量表达；INHA基因在苏尼特羊睾丸的表达量极显著高于小尾寒羊（P＜0.01），在肾上腺的表达量高于小尾寒羊，但差异不显著（P＞0.05）。

图2 INHA基因在公羊组织中的表达水平

3 讨论

公畜体内抑制素低水平表达可以促进精子的生成，提高生精量，从而增强公畜的繁殖能力。目前降低抑制素水平的主要方法之一是通过免疫INHA和RNAi抑制INHA基因表达，而INHA启动子的过甲基化与前列腺癌的发生［9-10］以及INHA启动子多态性与卵巢早衰的关系［11-12］都受到广泛的关注。

Voge等［13］通过主动免疫公绵羊的抑制素α亚基来测定公绵羊血液中促卵泡素、睾丸重量、生精量、睾酮和促黄体素水平，结果发现，抑制素α通过改变曲细精管在睾丸中的比例来提高精子产量。该研究小组同时发现，抑制素的降低能促进促黄体素对间质细胞合成和分泌睾酮（T）的作用，而睾酮在精子发生过程中具有十分重要的调控作用，是维持精子发生的关键因素之一。蔡开来［14］研究发现，在精子第一波生成的过程中，从第1天至第21天，INHA基因mRNA的表达量高于同时期的INHβ-A和INHβ-B mRNA的表达量，而且从第28天开始至小鼠精子完全形成及以后的性成熟时期，INHA、INHβ-A和INHβ-B mRNA都维持在一个较低的表达水平，且INHA的蛋白水平在第28天之前表达量较高，之后显著下降，并稳定表达在一个较低的水平。动物体促卵泡素、睾酮、促黄体素等共同构成精子发生的微环境，若精子发生过程中微环境动态平衡被打破，直接影响精母细胞的形态，正常精子比率大大减少。睾丸间质细胞和支持细胞功能是精子发生的基础，若抑制素或者睾酮分泌异常，便会影响睾丸生精作用的内分泌环境，从而影响生育力。本研究中INHA基因在苏尼特公羊睾丸中的表达量极显著高于小尾寒羊（P＜0.01），在肾上腺中的表达量也比小尾寒羊高，但其表达差异并不显著（P＞0.05），此结果与前人研究结果基本一致。

4 结论

本研究发现，INHA在小尾寒羊和苏尼特公羊睾丸中表达量最高，其次是肾上腺、附睾，在其他组织中均呈痕量表达。INHA基因在苏尼特羊睾丸中的表达量极显著高于小尾寒羊。暗示INHA基因可能主要在睾丸中对公绵羊繁殖功能发挥抑制作用。