益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠脂肪组织及瘦素、脂联素的影响

刘 颖，张 军，戴金颖，王顺意，戴金宇

(1. 河北省唐山市中医医院，河北 唐山 063000；2. 河北省唐山市丰润区人民医院，河北 唐山 064000)

近年来研究显示，肥胖尤其是腹型肥胖，是2型糖尿病的重要危险因素之一，是胰岛素抵抗的主要诱因[1]。脂肪组织作为胰岛素抵抗主要靶组织之一，不仅通过脂肪细胞本身的肥大增生及炎症反应的发生，参与调节胰岛素抵抗的进展，更可分泌瘦素、脂联素等一系列脂肪细胞因子，干预胰岛素信号系统的生理负反馈调节，直接诱导胰岛素抵抗的产生并调节胰岛素信号传导水平[2]。益气养阴活血方为临床治疗2型糖尿病胰岛素抵抗患者的经验方剂，尤其对气阴两虚兼瘀型效果显著。本实验旨在通过观察益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗状态下脂肪组织形态及血清瘦素、脂联素的影响，探讨其可能的作用机制，为其临床应用提供更多的理论依据。

1 实验资料

1.1 动物与饲料 健康雄性SPF级SD大鼠60只，约12周龄，体质量220～250 g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，动物许可证号：SCXK(军)2014-0001。基础饲料(B级)由北京科奥协力饲料有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2014-0010；高脂饲料(A级)由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2014-0008。

1.2 药物 益气养阴活血方：黄芪15 g，太子参15 g，熟地15 g，鬼箭羽15 g，山萸肉15 g，黄精15 g，葛根10 g，当归10 g，丹皮10 g，丹参30 g，三七粉2 g(此均为成人一日用药量)。以上中药材均购自中国中医科学院广安门医院，为产自广东一方制药的颗粒剂，根据公式(低剂量=每天正常人给药剂量÷人的体质量×6.25)计算大鼠给药量，并按照1∶2∶4比例选择低、中、高剂量，即13.75 g/kg、27.5 g/kg、55 g/kg。津力达颗粒：石家庄以岭药业股份有限公司(国药准字 Z20050845)，换算成大鼠的给药量为1.5 g/kg。应用时将上述颗粒剂溶于适量水中制成混悬液。

1.3 试剂和仪器 链脲佐菌素(STZ)由美国Cayman公司生产，大鼠瘦素(脂联素)ELISA检测试剂盒购自北京凯诺春天生物科技有限公司，甲醛溶液购自天津市永大化学试剂有限公司。血糖仪及配套试纸(美国拜耳医药保健有限公司)，组织包埋机(TB-718E，湖北泰维科技实业有限公司)，石蜡切片机(RM2245，德国LEICA公司)，烘片机(HI1220，德国LEICA公司)，生物显微镜(BX53，日本Olympus公司)，显微镜数码相机(DP80，日本Olympus公司)，多功能酶标仪(Infinite 200 PRO，瑞士帝肯有限责任公司)，全自动生化分析仪(Cobas-8000，德国罗氏制药有限公司)。

1.4 实验方法 60只健康雄性SD大鼠经普通饲料适应性喂养1周后，随机择取10只作为正常组，其余大鼠以高脂饮食饲养加小剂量STZ腹腔注射的方法建立2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型：大鼠以高脂饲料连续喂养4周，第5周开始禁食12 h后予一次性腹腔注射1%STZ溶液(STZ溶于0.1 mol/L pH 4.2柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中)30 mg/kg，继续高脂饲料喂养72 h，然后禁食12 h，大鼠尾尖采血检测空腹血糖(FPG)，以FPG≥11.1 mmol/L并稳定1周为成模标准。对未达标大鼠1周后等量重复给药，成模标准同前，成模率为97%。将成模大鼠按随机数字表法分为模型组10只、益气养阴活血方高剂量组10只、益气养阴活血方中剂量组9只、益气养阴活血方低剂量组10只和津力达组9只。益气养阴活血方低、中、高剂量组及津力达组以高脂饲料喂养，并分别予益气养阴活血方13.75 g/kg、27.5 g/kg、55 g/kg和津力达1.5 g/kg灌胃；正常组和模型组分别喂以普通饲料和高脂饲料，并以等量的生理盐水灌胃。各组每天同一时间灌胃1次，连续4周。

1.5 标本采集和指标检测 ①末次灌胃后，禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，试管静置20 min，在4 ℃下3 000 r/min离心15 min，取上清液，-20 ℃保存。采用ELISA法测定脂联素、瘦素、胰岛素(FINS)水平，采用生化法检测FPG水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(ISI，ISI呈非正态分布，故多采用其自然对数IAI进行统计)， HOMA-IR=FPG×FINS /22.5，ISI=1/FPG×FINS ，IAI=LnISI。②取大鼠肾周脂肪组织，于10%福尔马林溶液中充分固定24 h以上后，制作病理切片并进行HE染色。于200倍光镜下观察脂肪组织形态；于400倍光镜下观察脂肪细胞大小，并采用image-J软件测量脂肪细胞面积，计算脂肪细胞相对面积。

2 结 果

2.1 各组大鼠HOMA-IR、IAI比较 模型组大鼠HOMA-IR明显高于正常组(P<0.05)，IAI明显低于正常组(P<0.05)；益气养阴活血方各剂量组和津力达组HOMA-IR均明显低于模型组(P均<0.05)，IAI均明显高于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠HOMA-IR、IAI比较±s)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2 各组大鼠血清脂联素、瘦素比较 模型组大鼠脂联素水平明显低于正常组(P<0.05)，瘦素水平明显高于正常组(P<0.05)；益气养阴活血方各剂量组及津力达组大鼠脂联素水平均明显高于模型组(P均<0.05)，瘦素水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清脂联素、瘦素水平比较±s，ng/mL)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.3 各组大鼠脂肪组织形态学比较 200倍光镜下，正常组脂肪细胞体积较小，大小均等，细胞膜边界清晰，间质内较少炎细胞浸润和毛细血管扩张充血，见图1；模型组脂肪细胞体积较大，大小不等，细胞膜边界不清晰，细胞相交处有部分融合，有合成大细胞的倾向，间质内炎细胞浸润和毛细血管扩张充血明显增多，见图2；益气养阴活血方各剂量组及津力达组脂肪细胞体积中等，间质内炎细胞浸润和毛细血管扩张充血较模型组有所好转，见图3～6。400倍光镜下，各组脂肪细胞大小见图7～12，其中正常组大鼠脂肪细胞相对面积为1.00±0.21，模型组为6.18±0.49，益气养阴活血方低剂量组为3.21±0.28，益气养阴活血方中剂量组为2.60±0.31，益气养阴活血方高剂量组为2.90±0.34，津力达组为2.77±0.37。模型组脂肪细胞相对面积明显较正常组增大约6倍(P<0.05)，益气养阴活血方各剂量组及津力达组脂肪细胞相对面积均明显低于模型组(P均<0.05)。

图1 正常组脂肪组织镜下表现(HE，×200)

图2 模型组脂肪组织镜下表现(HE，×200)

图3 益气养阴活血方低剂量组脂肪组织镜下表现(HE，×200)

3 讨 论

胰岛素抵抗是指胰岛素靶组织对胰岛素的反应性和敏感性下降，导致机体糖脂代谢紊乱、体质量增加。胰岛素可通过刺激其靶组织对葡萄糖的摄取，调节碳水化合物的分解和糖异生，以供给机体正常生理所需能量，其机制与中医脾主运化的功能类似，而素体禀赋不足、饮食失节等均可致脾失健运，气血津液生化失源，致气阴两虚，气为血之帅，气虚则血行无力，津血同源，阴津不足则血凝炼，瘀血内生，故终呈气阴两虚兼瘀的虚实夹杂之证，临床中2型糖尿病胰岛素抵抗患者多为此型。益气养阴活血方即针对此证型而设，方中太子参、黄芪为君，补气健脾，使气旺以助血行，祛瘀不伤正；黄精、山萸肉、熟地、葛根为臣，益气养阴，补血生津，使气阴双补，扶助本虚之正气；当归、丹参、丹皮、三七粉、鬼箭羽为佐，凉血补血活血，兼去标实之邪气，使瘀去而气血流通，津液精微得以正常输布。诸药合用，共奏益气养阴、活血化瘀之功。现代药理研究也表明，方中太子参、黄芪、葛根、鬼箭羽等所含的多种有效成分，均能通过介导胰岛素信号的传导，调节瘦素、脂联素等细胞因子表达，或直接作用于胰岛β细胞，调节糖脂代谢，增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗状态[3-4]。本实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠ISI降低，HOMA-IR升高，大鼠呈现明显的胰岛素抵抗状态，经益气养阴活血方干预后，各组大鼠ISI升高，HOMA-IR降低，证实益气养阴活血方确能明显提高机体对胰岛素的敏感性，改善大鼠胰岛素抵抗状态。

图4 益气养阴活血方中剂量组脂肪组织镜下表现(HE，×200)

图5 益气养阴活血方高剂量组脂肪组织镜下表现(HE，×200)

图6 津力达组脂肪组织镜下表现(HE，×200)

图7 正常组脂肪细胞大小(HE，×400)

图8 模型组脂肪细胞大小(HE，×400)

图9 益气养阴活血方低剂量组脂肪细胞大小(HE，×400)

图10 益气养阴活血方中剂量组脂肪细胞大小(HE，×400)

图11 益气养阴活血方高剂量组脂肪细胞大小(HE，×400)

图12 津力达组脂肪细胞大小(HE，×400)

脂肪组织是胰岛素的主要效应组织之一，具有活跃的内分泌功能，可分泌脂联素、瘦素等多种细胞因子，参与机体代谢，双向调节胰岛素抵抗。脂联素是目前发现的唯一一种和机体脂质含量呈负相关的细胞因子，是脂肪组织与机体代谢的纽带，可通过刺激脂肪代谢并抑制其合成，同时促进胰岛β细胞分泌胰岛素，达到改善糖脂代谢紊乱、抗炎和增加胰岛素敏感性的作用[5-6]。而脂肪组织的肥大会导致机体脂联素基因表达和血清水平显著降低，抑制周围组织对葡萄糖的摄取和对炎症的调节作用，进而增加胰岛素抵抗发生的风险[7-8]。瘦素也是评估胰岛素抵抗的重要指标[9]，生理状态下，瘦素可作用于下丘脑食欲中枢，抑制神经肽Y，并激活对ATP敏感的钾离子通路，干预胰岛素分泌，调节机体对胰岛素的敏感性[10]，防止高胰岛素血症和胰岛素抵抗的发生。但肥胖者因其自身下丘脑上瘦素受体对瘦素的敏感性下降，瘦素反应性分泌增加，产生瘦素抵抗，使瘦素对胰岛素的负反馈调节机制受到破坏，进而诱发胰岛素抵抗[11]。本实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠脂联素水平明显降低，瘦素水平明显升高，与机体的胰岛素抵抗状态相符，并提示大鼠产生了瘦素抵抗，经益气养阴活血方干预后，各组大鼠脂联素水平明显升高，瘦素水平明显降低，表明益气养阴活血方或可通过增加脂联素分泌，缓解瘦素抵抗，调节机体的能量代谢，改善胰岛素抵抗状态。

脂肪组织也是调节脂质代谢的主要内分泌器官，当机体能量摄入过多时，大量脂质过度沉积在脂肪组织中，超过脂肪的储存能力，则可导致脂肪组织扩张，即脂肪细胞面积增大和数目增多，肥大的脂肪细胞表面胰岛素受体减少，对胰岛素亲和力下降，可诱发胰岛素抵抗，同时伴随脂肪细胞的肥大增生，氧分压降低，脂肪组织处于相对缺氧的状态，其正常的生理功能受到抑制，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子大量分泌，抑制了脂肪组织正常的胰岛素信号转导，致使脂肪组织合成能力降低，靶组织对葡萄糖的摄取及对胰岛素的敏感性降低，引发胰岛素抵抗，因此不少学者将脂肪细胞的肥大看作胰岛素抵抗的独立标志[12-13]。本实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠脂肪细胞体积明显增大，间质内炎细胞浸润明显增多，说明随大鼠胰岛素抵抗的发生，其脂肪细胞也表现出了典型的肥大特征及炎症反应状态，经益气养阴活血方干预后，各组大鼠脂肪细胞体积及间质内炎细胞浸润明显减少，说明益气养阴活血方可明显改善胰岛素抵抗大鼠脂肪细胞的肥大和炎症反应，缓解大鼠脂肪组织的胰岛素抵抗状态。

综上所述，脂肪组织及其分泌的脂肪细胞因子与胰岛素抵抗的发生发展关系密切，而益气养阴活血方能有效改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗状态，其作用的发挥可能与其改善脂肪细胞肥大和炎症反应，并正向调节血清中瘦素、脂联素水平有关，这也提示，以脂肪组织为靶点，检测并改善患者瘦素、脂联素水平，或可成为诊治2型糖尿病胰岛素抵抗的新思路。