地卓西平马来酸盐腹腔注射对大脑中动脉闭塞大鼠神经功能的影响及其机制

马英，刘星，杨春壮，王子轩，雷瀛，王林林

(牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011)

脑血管病具有高发病率、病死率、致残率、复发率的特点，对人类生命安全和健康造成严重的危害，临床上以缺血性脑血管病多见。缺血性脑血管疾病多为局灶性，以大脑中动脉闭塞(MCAO)多见。部分梗塞患者由于溶栓治疗或栓子自发向远端推移，出现血管再通即再灌注现象。地卓西平马来酸盐(MK-801)是离子型谷氨酸受体拮抗剂，可阻断N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体，明显降低脑缺血再灌注引起的脑损伤。有研究认为，MK-801可降低Ca2+浓度，维持Ca2+在细胞内外的平衡，抑制兴奋性氨基酸毒性，促进神经干细胞(NSCs)的增殖，同时抑制神经元的凋亡，在治疗脑损伤、缺血性脑血管疾病、抗惊厥等方面发挥重要作用[1,2]。MK-801在脑缺血再灌注后对神经元的保护作用已得到初步证实，但其作用机制尚不明确。本研究观察了MK-801对MCAO大鼠神经功能的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康Wistar大鼠108只，雌雄各半，体质量200～350 g，由牡丹江医学院医药研究中心提供，实验动物许可证号为SYXX(黑)2015-007。

1.2 药物、仪器及试剂 MK-801(美国Sigma公司)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo热电上海仪器有限公司)；神经生长因子β(NGFβ)酶联免疫试剂盒(武汉博士德生物公司)；巢蛋白(NES)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)。

1.3 实验动物分组、MCAO模型制备及MK-801给予方法 108只大鼠随机分为药物组、模型组、对照组各36只。药物组、模型组均制备MCAO模型[3]，即大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)，仰卧并固定于鼠板上，在大鼠颈部前正中线纵行切口，长2.0～2.5 cm，钝性分离筋膜、肌肉及甲状腺腺体，注意减少刺激迷走神经，分离并结扎右侧颈总动脉(CCA)，再穿一线备用。分离颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，结扎ECA，用微动脉夹夹闭ICA，在近CCA分叉处剪一V形切口，将直径为0.2～0.25 mm尼龙线头端涂抹硅胶脂，沿CCA插入ICA，同时放开微动脉夹，轻轻牵拉使栓线进入颅腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，说明线栓已阻断大脑中动脉(MCA)的入口，造成MCA阻塞。将CCA上的备线扎紧，防止线栓滑出，缝合伤口，涂抹青霉素抗炎。1 h后，缓慢退出部分线栓进行再灌注。对照组只做手术暴露颈部动脉，结扎CCA，但不予线栓。制模后大鼠清醒后腹腔注射MK-801(用0.9%生理盐水配置成浓度为0.06 mg/mL的溶液)，1次/d，给药14 d；模型组和对照组腹腔注射等量生理盐水。

1.4 大鼠神经功能评价 在制模第3、7、14 d大鼠处死前分别进行神经功能评分[4]。无神经功能缺损表现计0分，提尾悬空时左前爪不能伸展计1分，行走时向左侧转圈计2分，行走困难、并不时地向左侧倾倒计3分，不能自主行走、意识下降计4分。

1.5 大鼠大脑皮质NGF、NES检测 各组动物分别于制模第3、7、14 d禁食过夜，在每个时间点随机选取8只处死，迅速在冰盘上修取MCA供血区(右侧缺血侧)的大脑皮质，用滤纸处理掉黏附的脑脊液和血液，称重标记后按1∶9的比例配入冰生理盐水，置于匀浆器匀浆，离心机以3 000 r/min离心30 min，取上清，采用ELISA法检测NGF，结果以OD值表示。同时每组每个时间点将剩余4只进行常规灌注固定，取出大脑，取MCA供血区(右侧缺血侧)中间部分的大脑皮质，置于4%多聚甲醛固定液中，4 ℃浸润固定，经石蜡包埋，连续冠状切片(5 μm)，采用免疫组化法检测NES，每例标本检测4张切片，每张切片各取5个高倍视野(40×)，测定NES累积光密度值和总面积，把两者的比值作为平均光密度值(IOD值)，最后计算每组动物的均值。

2 结果

2.1 各组制模3、7、14 d大鼠神经功能评分比较 结果见表1。

表1 各组大鼠制模3、7、14 d神经功能评分比较(分，

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.2 各组大鼠制模3、7、14 d大脑皮质NGF OD值比较 结果见表2。

表2 各组大鼠制模3、7、14 d大脑皮质NGF OD值比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.3 各组大鼠制模3、7、14 d脑皮质NES IOD值比较 结果见表3。

表3 各组大鼠制模3、7、14 d脑皮质NES IOD值比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨论

缺血性脑血管病是指局部脑组织包括神经细胞、胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的变性、坏死或一过性的功能丧失。脑动脉一旦受到阻塞，脑组织就会以为没有足够的血液灌注，而引发脑血管缺血、缺氧，缺血性脑血管病的一系列生理、病理的演变过程也随之开始，而这一演变过程的最终结果就是神经元死亡及神经功能缺损。缺血性脑血管病是一种常见病，发病后对患者造成的损伤很大，且很难彻底治愈，影响其发病的因素很多也很复杂。最常见的治疗方法仍是药物治疗，因此如何合理地选择治疗的药物已成为目前缺血性脑血管病讨论的焦点。

脑缺血性损伤时，谷氨酸在突触间隙中积聚，NMDA受体过度兴奋，从而引发Ca2+超载、NO生成增多等级联式毒性反应，最终导致神经细胞死亡[5～7]。MK-801是特异性最强、效能最高的非竞争性NMDA受体拮抗剂，主要作用于NMDA受体之苯环己派啶位点，阻断与之耦联的Ca2+通道，抑制Ca2+内流，从而减轻NMDA受体激动所引发的神经损伤，有研究表明[8]，MK801可能通过间接抑制脂质过氧化损伤作用,维持神经元细胞膜的完整性,减弱促凋亡相关蛋白表达。从而对缺血再灌注后的脑组织具有一定的保护意义。从而在治疗脑损伤、缺血性脑血管疾病及抗惊厥等方面发挥重要作用[9]。

实验性脑缺血的行为学评价方法可分为神经学检查、感觉运动功能的评价和认知功能的评价。感觉运动功能的评价多用于实验性脑缺血后运动功能恢复的远期过程，此评价能较准确地反映动物不同程度脑缺血后的运动和感觉功能损伤，是较神经学检查更敏感且定位相对准确的功能障碍评价方法。本研究显示，药物组第3、7天神经功能评分与模型组比较无差异，制模14 d神经功能评分低于模型组，提示MK-801可改善脑缺血大鼠的神经功能，具有神经保护作用，但需要一定的时间。

NGF在中枢及周围神经系统有广泛分布，其与受体p75NTR和TrkA结合后，能对神经元的生存、生长、增殖、分化、迁移及突触的形成和连接起促进作用[10～12]。有研究[13]表明，成年哺乳动物因脑缺血造成的神经功能损伤产生代偿性和修复作用，与缺血、缺氧导致中枢神经系统的内环境发生改变，诱导各种NGF的表达发生变化有关。本研究显示，对照组NGF表达在制模后几天无明显差异，模型组从制模后第3天开始表达升高，第7天达到高峰，接近对照组的水平，到第14天表达下降。这一结果也证实脑缺血后可引起内源性NGF表达增加，但此过程只使内源性NGF短暂表达增加，不能全面且持久地保护受损神经元。本研究还发现，药物组不同时间点NGF OD值均高于模型组和对照组。说明MK-801能促使MCAO大鼠在脑缺血时的NGF产生量增加、产生时限延长，从而对受损伤神经元发挥更好的保护作用。

NES属于一种胚胎性第Ⅵ类中间丝蛋白，主要分布在胚胎发生期的中枢神经系统，并在干细胞增殖旺盛阶段出现大量表达，参与细胞骨架的构成。从成年大鼠中枢神经系统中分离出的NES阳性细胞在体外培养呈集落性生长，并分化出神经元和胶质细胞的前体细胞，从而说明NES阳性细胞具有干细胞特征。目前，NES作为中枢神经系统发育过程中NSCs的特异性标记物被广泛应用于NSCs的鉴定[14,15]。研究认为，在脑缺血情况下，神经干细胞可以增殖并迁移到病灶区，进而产生定向分化[16,17]。于东强等[18]报道，雄性Wistar大鼠在局灶性脑缺血再灌注损伤后，缺血同侧及对侧海马区NES阳性细胞数量增多，7 d达到高峰，表明神经干细胞参与了脑缺血再灌注损伤后神经的自我修复。本文结果显示，药物组和模型组不同时间点NES表达均高于对照组，药物组不同时间点NES表达均高于模型组，可见脑缺血后机体内部的NES蛋白被激活，经MK-801的作用表达得更为明显。这表明MK-801可增强NES阳性细胞的表达，刺激内源性NSCs激活，进而增殖、分化及定向迁移，并分化出神经元和胶质细胞的前体细胞，达到修复和重塑受损神经的作用。但此过程具体机制目前还不十分明确，本研究认为这与MK-801抑制兴奋性氨基酸毒性、调节微环境(生长因子、细胞因子)有关。

总之，MK-801可改善MCAO大鼠神经功能，其机制可能是通过增加MCAO大鼠大脑皮质内NGF、NES水平来实现。