丹参酮ⅡA对髓母细胞瘤的增殖 凋亡及自噬的影响*

项 荣,邹 剑

(成都市第五人民医院药剂科 611130)

髓母细胞瘤是儿童最为常见的颅内肿瘤，占儿童颅内肿瘤总数的12%～25%，一般认为髓母细胞瘤起源自原始神经胚胎残余上皮细胞，恶性程度非常高，为WHO中枢神经系统Ⅳ级肿瘤[1-2]。髓母细胞瘤侵袭、转移性很强，易通过脑脊液侵袭至软脑膜，手术切除后易复发，且对放化疗不敏感，预后极差，因此寻找治疗髓母细胞瘤的新药物尤为重要[3]。丹参酮ⅡA为中药丹参的重要活性成分，是由乙醇或乙醚从丹参根中提取出的樱红色针状结晶，临床主要用于心血管疾病的治疗[4]。近年研究发现，丹参酮ⅡA还具有抗肿瘤的功效，其对肺癌、肝癌、白血病、乳腺癌等各类肿瘤细胞均具有毒性作用，能够抑制癌细胞增殖，促进癌细胞分化、凋亡，抑制癌细胞侵袭、转移，其作用机制可能与DNA合成被抑制、原癌和凋亡基因表达异常等有关[5-6]。丹参酮ⅡA对髓母细胞瘤细胞增殖和凋亡的作用还少见报道。本研究旨在探究丹参酮ⅡA对人髓母细胞瘤D341细胞增殖、凋亡及自噬的影响，并检测凋亡与自噬相关蛋白的表达变化，探讨丹参酮ⅡA治疗髓母细胞瘤的潜在价值，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞株、试剂与仪器 人D341细胞株购自北京协和医院细胞库；丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(规格：2 mL∶10 mg，批准文号：国药准字H31022558)购自上海第一生化药业有限公司；RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清均购自美国Gibco公司；Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自成都艾特姆生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒购自上海歌凡生物科技有限公司；一抗兔抗人雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗体均购自Bioworld生物科技公司；一抗兔抗人微管蛋白1轻链3-Ⅰ/Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ)、Beclin1多克隆抗体及二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG均购自美国Santa Cruz公司；透射电子显微镜购自日本JEM-1011公司；EPICSXL流式细胞仪购自美国Beckman Couhe公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将适量D341细胞置入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)中，并在37 ℃、5% CO2、湿度饱和的恒温箱中培养。

1.2.2MTT法检测细胞增殖 将D341细胞用培养基调整为5×107/L，按每孔200 μL细胞悬液接种至96孔板中，培养24 h后加入丹参酮ⅡA，终浓度依次为0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，设置6个复孔，以不加丹参酮ⅡA的孔作为空白对照；分别在培养24、48、72 h后，向每孔加入20 μL MTT液[5 mg/mL，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解]，在37 ℃、5% CO2恒温箱中继续培养4 h后，小心弃去上清液，向每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，摇床振荡10 min充分溶解结晶；用酶标分析仪测定450 nm波长处各孔的吸光度(A)值，每组重复测定3次，求取均值。细胞增殖抑制率=(空白对照组A450 nm-给药组A450 nm)/空白对照组A450 nm×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 将D341细胞调整为5×107/L，按每孔200 μL悬液接种至96孔板，培养24 h后加入丹参酮ⅡA，终浓度依次为0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，设置6个复孔；在培养72 h后，用0.01 mol/L PBS洗涤2遍后，收集细胞；用500 μL结合缓冲液重悬细胞，接着加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后避光孵育15 min；用EPICSXL流式细胞仪采集数据，并用Cell Quest软件分析凋亡细胞百分率。

1.2.4透射电镜观察细胞自噬 将培养的D341细胞分为空白对照组和5.0 mg/L丹参酮ⅡA；在培养72 h后，收集细胞；固定于含2.5%戊二醛、2%多聚甲醛的PBS中2 h以上；0.1 mol/L PBS洗涤；梯度乙醇脱水；丙酮包埋液包埋；先后置于37、45、60 ℃烘箱中固化；以50～60 nm厚度超薄切片；最后在透射电镜下观察并拍照。

1.2.5Western blot检测细胞mTOR、p-mTOR、VEGF、LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白表达 将D341细胞调整为5×107/L，向96孔板每孔接种200 μL悬液，待细胞贴壁生长后加入丹参酮ⅡA，终浓度依次为0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，设置6个复孔；在培养72 h后，向对应孔加入适量PMSF裂解液，常规提取细胞蛋白，用BCA法定量蛋白并调好浓度。每组取50 μg蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水浴使蛋白变性；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳；转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于含5%脱脂奶粉TBST溶液避光封闭1 h；TBST漂洗后，将膜置于一抗稀释液(mTOR、p-mTOR、VEGF均为1∶100，LC3-Ⅰ/Ⅱ为1∶150，Beclin1为1∶1 000)中，4 ℃孵育过夜；次日早晨TBST漂洗后，置于二抗稀释液(1∶5 000)中，摇床室温孵育1 h；TBST漂洗后，发光液均匀加于膜上，5 min后吸去多余溶液，置于暗盒中曝光、显影、定影。使用GIS-2020系统扫描并分析蛋白杂交条带。以β-actin为内参蛋白。

2 结 果

2.1丹参酮ⅡA对D341细胞增殖的影响 MTT结果显示，随着给药浓度的增加，丹参酮ⅡA对D341存活的抑制作用不断增强，差异有统计学意义(P<0.05)；同一丹参酮ⅡA浓度下，随着作用时间延长，D341细胞增殖抑制率亦逐渐降低，见表1。

2.2丹参酮ⅡA对D341细胞凋亡的影响 流式细胞仪结果显示，丹参酮ⅡA可显著诱导D341细胞凋亡(P<0.05)，随着给药浓度的增加，D341细胞凋亡率不断增加(P<0.05)，见图1。

A:0 mg/L丹参酮ⅡA;B:0.5 mg/L丹参酮ⅡA;C:1.0 mg/L丹参酮ⅡA;D:2.0 mg/L丹参酮ⅡA;E:5.0 mg/L丹参酮ⅡA

图1丹参酮ⅡA处理D341细胞72 h时流式细胞仪检测结果

表1 不同浓度丹参酮ⅡA对D341细胞存活率的影响

a：P<0.05，与丹参酮ⅡA 0 mg/L比较

2.3丹参酮ⅡA对D341细胞自噬的影响 透射电镜结果显示，对照组D341细胞膜完整，染色质呈均匀分布；5.0 mg/L丹参酮ⅡA处理72 h时发现，细胞核染色质浓缩、边缘化，一些细胞明显裂解，细胞质中可见空泡结构，见图2。

A:0 mg/L丹参酮ⅡA;B:5.0 mg/L丹参酮ⅡA

图2丹参酮ⅡA处理D341细胞72 h时透射电镜检测结果

2.4丹参酮ⅡA对D341细胞mTOR、p-mTOR、VEGF表达的影响 Western blot结果显示，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，D341细胞中mTOR蛋白表达水平变化不明显(P>0.05)，p-mTOR和VEGF蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)，见图3、表2。

图3 丹参酮ⅡA对D341细胞中mTOR、p-mTOR、VEGF表达的影响

表2 D341细胞中mTOR、p-mTOR、VEGF蛋白相对表达灰度值

a：P<0.05，与丹参酮ⅡA 0 mg/L比较；以β-actin作为内参基因

图4 丹参酮ⅡA对D341细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ表达的影响

2.5丹参酮ⅡA对D341细胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin1表达的影响 Western blot结果显示，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，D341细胞中LC3-Ⅰ蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)，Beclin1蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。见图4、表3。

表3 D341细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin1蛋白相对表达灰度值

a：P<0.05，与丹参酮ⅡA 0 mg/L比较；以β-actin作为内参基因

3 讨 论

丹参酮ⅡA是从中药丹参中提取出的脂溶性物质，可抵抗多类肿瘤细胞，近年该药物的抗癌机制研究成为基础医学领域的研究热点。丹参酮ⅡA能够从多方面发挥抑瘤作用：阻滞肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖、转移、侵袭，诱导肿瘤细胞分化、凋亡，降低肿瘤细胞黏性，以及诱导肿瘤细胞自噬，但其具体调控机制还需深入研究[7-9]。

本研究结果显示，随着给药浓度的增加，丹参酮ⅡA对D341细胞增殖、凋亡的抑制作用不断增强，而且同一浓度下，随着时间延长，D341细胞增殖、凋亡抑制率亦逐渐增加，说明丹参酮ⅡA可抑制D341细胞增殖、诱导D341细胞凋亡。mTOR是最初从酵母中发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，随后发现其在哺乳动物中也广泛存在，有助于细胞检测周围营养物质而调控细胞的增殖、生长和代谢。在人体内，mTOR作为分子传感器，使细胞对正常或极端的内环境做出正确应答[10-12]。有关研究发现，mTOR信号通路主要调控细胞周期G1期相关蛋白的合成，与多类恶性肿瘤的生长、增殖、分化、凋亡等关系密切，起着重要的调控作用，mTOR被过度磷酸化激活后可导致癌症发生，故抑制mTOR通路能阻滞细胞周期进展，从而促进细胞凋亡[13-14]。本研究Western blot结果显示，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，D341细胞中mTOR蛋白表达水平变化不明显，mTOR蛋白的磷酸化水平逐渐降低，说明丹参酮ⅡA对mTOR蛋白表达无明显作用，但可抑制mTOR蛋白的磷酸化。肿瘤血管不断新生是肿瘤生长、迁移的关键，VEGF为很常见的血管生长促进因子[15-16]。本研究发现，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，D341细胞中VEGF蛋白表达水平逐渐降低，说明丹参酮ⅡA可能通过抑制VEGF相关通路而促进D341细胞凋亡。

自噬能消化构型异常的蛋白质、多余或受损的细胞器为细胞提供养分与能量，是真核细胞特有的保护机制[17]。大量研究表明，自噬与肿瘤、感染、神经退化、炎症等疾病的发生、发展过程有关[18]。本研究透射电镜结果显示，对照组D341细胞膜完整，染色质呈均匀分布；5.0 mg/L丹参酮ⅡA处理72 h时发现，细胞核染色质浓缩、边缘化，一些细胞明显裂解，说明丹参酮ⅡA可促进D341细胞自噬。自噬相关蛋白LC3在进化过程中高度保守，为自噬体产生的标志，可特定地反映出胞内自噬体的多少。LC3包括Ⅰ型与Ⅱ型，LC3-Ⅰ定位在细胞质内，其可与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位在自噬体膜的表面，参与自噬体的形成，常被用于衡量细胞自噬的程度[19]。Beclin1是首先被发现促进肿瘤细胞自噬的因子，在各类恶性肿瘤中Beclin1蛋白表达较正常组织下调，其杂合子的异常缺失也可能为肿瘤恶化的一个重要原因[20-21]。Western blot结果显示，随着丹参酮ⅡA浓度的增加，D341细胞中LC3-Ⅰ蛋白表达水平逐渐降低，LC3-Ⅱ蛋白表达水平逐渐升高，Beclin1蛋白表达水平逐渐升高，说明丹参酮ⅡA可能通过上调LC3-Ⅱ、Beclin1表达和下调LC3-Ⅰ表达来促进D341细胞自噬。

综上所述，本研究发现丹参酮ⅡA可抑制髓母细胞瘤D341细胞增殖，诱导D341细胞凋亡，促进D341细胞自噬，且可能与p-mTOR、VEGF、LC3-Ⅰ表达下调及LC3-Ⅱ、Beclin1表达上调有关。然而肿瘤发生、发展的相关影响因素很多，机制复杂，丹参酮ⅡA对D341细胞的抑制作用还需继续深入地探究。