连续色谱法分离甘蔗叶提取物制备阿拉伯糖和木糖的研究

钱朋智，张梅娟

（1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔161006）

木糖主要是通过无机酸水解富含半纤维素的原料生成，制备方法主要有中和脱酸法、离子交换脱酸法、电渗析脱酸法、结晶法、层析分离法[1]。用木聚糖酶进行玉米芯的水解试验，技术上完全是可能的，但必须在外切型木聚糖酶作用下，才可以酶解得到较多的木糖，酶法生产木糖得率较低，周期较长，目前尚处于研究室阶段[2]。L-阿拉伯糖早期的提取方法为Tschiersch B等发明的碱提取法[3]，主要利用甜菜粕为原料，经过碱提、酸解、色谱分离等工序，得到阿拉伯糖，该方法分离难度大、设备投入高；冯亚青等发明了用两柱法从阿拉伯胶中提取L-阿拉伯糖的方法[4]，主要以阿拉伯胶为原料，经酸解、中和、浓缩、乙酸沉淀、两柱分离，得到L-阿拉伯糖，该方法处理工作量大，难于大规模工业化生产；Loeza-Come J.M[5]等利用具有α-L-阿拉伯糖苷酶活性的天然酶水解牧豆树胶生产L-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖收率仅为17.04%；Kim KS等[6]用3，4二氢-2H-吡喃经硒的羟基化反应合成了阿拉伯糖，但此方法产物D、L型的消旋体，需要拆分，且所用原料较贵、步骤较多。郭军伟等[7]同样以阿拉伯胶为原料，氢氧化钡中和后的水解液经发酵除去D半乳糖，在甲醇中结晶分离制得粗L-阿拉伯糖，加水配成质量分数为50%的糖液，结晶后得到的L-拉伯糖产率为15.6%，纯度为97.5%。

甘蔗叶木聚糖含量达22%～25%，如果能够利用丰富的蔗叶资源生产高附加值产品木糖，对于蔗糖产业的综合利用，具有十分重大的意义[8]。本试验采用Septor IX转盘系统，树脂柱安放在同一个转盘上，旋转阀板与转盘同步旋转，真正实现柱床移动，可大量节省树脂量，实现不同工艺的变更和调整，简单直观，木糖、L-阿拉伯糖收率、浓度及纯度高且稳定性高；一般只采用水或某一种解析剂，不具有强腐蚀性，三废排放量极少，减少环保压力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料 甘蔗叶，采自广西南宁蔗田。

1.1.2 主要试剂 活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；离子交换树脂：江苏苏青水处理有限公司；硫酸、氢氧化钠等均为分析纯。

1.1.3 主要设备 有机玻璃离子交换柱：江苏金三阳水处理科技江苏有限公司；SGD-Ⅳ型全自动还原糖测定仪：山东科学院生物研究所；高效液相色谱仪：浙江大学智达信息工程有限公司；Rezex RCMMonosaccharide Ca2+色谱柱（带钙型保护柱）：广州菲罗门仪器有限公司；20柱连续色谱Septor IX转盘系统：三达膜环境技术股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验工艺路线 甘蔗叶粉碎→热水预处理→稀硫酸水解→水洗回收糖→第一次脱色→第一次浓缩→第二次脱色→第一次离子交换→第二次浓缩→第二次离子交换→第三次浓缩→结晶→分离→木糖母液（→木糖）→稀释→脱色→离子交换→浓缩→连续色谱分离系统（→木糖）→结晶→阿拉伯糖。

1.2.2 测定方法 总可溶性固形物含量采用手持式折光仪[9]；电导率值及pH测定按照说明书进行；透光度测定采用分光光度法[9]；高效液相色谱面积归一法进行纯度检验。以超纯水为流动相，柱温75℃，检测器温度35℃，流速0.6mL/min，进样量20 μL。样品经0.45μm滤膜过滤后进样。

1.2.3 组分收率的计算方法 收率计算：收率（%）=（M1×C1×A1）÷（M0×C0×A0）×100%

式中，M1—分离后阿拉伯糖（木糖）组分溶液的重量；C1—分离后阿拉伯糖组分（木糖）的折光浓度（%）；A1—分离后阿拉伯糖组分（木糖）的纯度（%）；M0—分离前料液溶液的重量；C0—分离前料液中阿拉伯糖（木糖）组分的折光浓度（%）；A0—分离前料液中阿拉伯糖（木糖）组分的纯度（%）。

1.2.4 烘干后的产品得率计算方法 收率（%）=M1/M0×100%。式中，M1—烘干后的阿拉伯糖（木糖）晶体重量；M0—木糖母液的重量。

1.3 甘蔗叶木糖母液的预处理

1.3.1 稀释 45℃条件下，搅拌器转速120r/min，用纯水将粘稠的木糖母液稀释至折光浓度20%左右。

1.3.2 发酵去除葡萄糖 活性干酵母粉按照0.2%的比例加入到稀释后的木糖母液中，发酵至葡萄糖含量1%以下，发酵后的料液用布氏漏斗真空抽滤回收酵母，收集过滤液备用。

1.3.3 脱色 按过滤液重量的0.5%添加粉末活性炭，脱色温度80℃，保温时间30min，脱色完毕用布氏漏斗真空抽滤，得到脱色液。脱色后的料液指标：透光≥85%。

1.3.4 离子交换 将脱色液经过离子交换柱进行净化处理，离子交换柱的顺序为弱阴离子交换树脂柱-强阳离子交换树脂柱-强阴离子交换树脂柱。出料要求：折光≥15%，透光≥95%，电导≤10μS/cm，pH=5～7。

1.3.5 真空浓缩 利用旋转蒸发仪对上述的离子交换后的溶液进行真空蒸发浓缩。温度80℃，转速25r/min，

浓缩至折光40%～45%。

1.4 连续色谱分离

采用20根柱的Septor IX连续移动床设备分离母液，柱子中共装填色谱层析树脂16L。流程简介如下：

（1）把连续移动床的20根树脂柱分为4个区，每个区实现不同的功能，其中第Ⅰ区1～5#柱为洗脱区，用于洗脱已经分离出来的L-阿拉伯糖；第Ⅱ区6～10#为二级分离区，主要是提高L-阿拉伯糖纯度、浓度；第Ⅲ区11～15#为一级分离区，主要是分离出D-木糖；第Ⅳ区16～20#为浓缩回流区，提高D-木糖浓度，第Ⅳ区的出水，可以回用到Ⅰ区作为进水。

（2）待分离的物料从第Ⅲ区进入系统，液流方向从左到右推动结合力弱的D-木糖组分迁移，而树脂柱则由右向左逆向移动，把结合力强的组分L-木糖夹带逆向移动，从而实现分离。

（3）经过第Ⅱ区和第Ⅲ区的分离，基本实现L-阿拉伯糖和D-木糖的分离，D-木糖从第Ⅲ区流出；而L-阿拉伯糖则在树脂柱的逆向运动作用下带到第Ⅰ区。

（4）L-阿拉伯糖到达第Ⅰ区后，在洗脱水的推动力作用下流出。

（5）D-木糖进入第Ⅳ区后，经过反复上下柱，实现D-木糖组分的浓缩，出水可返回到第Ⅰ区循环利用。

以料液处理量、产品的浓度、纯度、收率等为考察指标，经过反复验证，系统运行稳定后，确定最佳的转盘周期、各区域流速等参数。实验结果汇总后，计算各组分的纯度和收率。

1.5 L-阿拉伯糖的结晶与木糖回收

将连续色谱分离移动床收集的L—阿拉伯糖组分溶液通过0.22μm微膜过滤，利用旋转蒸发仪一步蒸发为折光浓度83%的糖浆，导入立式结晶器中，经降温结晶，离心机分离、干燥工序得到外观洁白、流动性好、结构松散的结晶性L-阿拉伯糖粉末。过滤后的糖浆，导入立式结晶器中进行循环水冷却降温结晶，使木糖析出，最后经三足离心机分离、干燥得到结晶性木糖粉末。参数控制：木糖糖浆导入完毕后，降温结晶，离心分离、烘干，得到结晶性粉末状的木糖产品。采用高效液相色谱面积归一法测定L—阿拉伯糖和木糖产品纯度。

2 结果与讨论

2.1 蔗叶提取工艺

甘蔗叶中木聚糖水解的三要素——酸浓度、水解温度和水解时间。水解反应速度与酸的浓度并不成直线关系，在低浓度时，酸的浓度增加，反应速度增加较快，当酸的浓度增加到一定程度时，随着酸浓度的增加，反应速度的增加并不明显了，而且会加大副反应，致使粘胶酸、糖醛酸和蛋白质中的氨基酸以及纤维素等不同程度地水解，增加了水解液中的非糖物质、有机酸和色素的含量，加大了水解液的净化难度；增加反应温度会提高甘蔗叶中木聚糖的水解速度，增加水解物的收率，但温度过高会使木糖脱水生产糠醛，也会使木糖和其他糖反应产生焦糖，增加水解液的色素，影响水解液的质量；水解时间越短越好，时间短可以提高设备利用率，降低消耗和成本，提高经济效益，但从化学反应角度来看，反应时间越长，反应越充分，产率越高，但时间过长，也会造成副产物的产生，影响水解液的质量。

经过正交试验优化出最佳的水解工艺参数：硫酸浓度1.2%、固液比1∶8、水解时间120min、水解温度123℃。离心后的水解液经过脱色、离子交换、浓缩、结晶等多步分离纯化工序，制备出外观洁白、晶体均匀一致、流动性好的木糖晶体，产品得率为7.14%，即96.8kg绝干蔗叶生产8.8kg木糖。

高效液相色谱检测木糖产品的条件：以超纯水为流动相，采用Rezex系列Ca2+型糖醇柱（带保护柱）做分离柱，选用示差折光检测器，柱温75℃，检测器温度35℃，分离流速为0.6mL/min，木糖产品经0.45μm滤膜过滤后进样，进样量20μL。经高效液相色谱检测，木糖产品的纯度为99.93%，符合GB/T 23532-2009的要求。离心后的结晶木糖母液备用。

2.2 木糖母液的稀释

高效液相色谱检测木糖母液：经高效液相色谱仪分析，木糖母液中的葡萄糖纯度10.5%，木糖纯度60.8%，L-阿拉伯糖纯度13.7%。

称重木糖母液重量为8.68kg，总可溶性固形物浓度为60.2%，透光度为5.5%，电导率为500μS/cm。

由检测结果得知木糖母液残糖浓度高、粘度很大。木糖母液浓度越高，酵母菌种生长所面临的抑制物浓度就越高。另外，较高的木糖母液浓度使酵母细胞处于较高的渗透压状态，对酵母的生长及代谢都有很大的影响。因此，考虑到酵母的耐高渗能力和葡萄糖的去除效果，发酵时母液浓度不能过高。所以，需要将木糖母液先进行稀释，但从经济效益和推广应用可行性考虑，母液的稀释倍数也不宜过大。

以脱除葡萄糖效果为指标，经单因素试验得出，将粘稠的木糖母液稀释至折光浓度20%左右时，活性干酵母的耐渗透压能力以及脱除葡萄糖的效果最佳。45℃、120r/min，添加适量纯水将母液稀释，稀释后测得料液指标：透光度为13.1%，pH为4.5，电导率为1680μS/cm，总可溶性固形物浓度为20%。

2.3 发酵去除葡萄糖

发酵过程中，酵母的接种量、发酵温度、搅拌速度等条件都会对发酵过程产生极大的影响。以脱除葡萄糖效果为指标，经正交因素试验得出，按稀释后的料液重量的0.2%添加活性干酵母粉，pH自然，温度25℃，鼓风充氧，搅拌器转速100r/min，发酵时间4.5～6h，效果最好。

本试验采用开放式发酵，母液无需灭菌，敞口发酵，定时用生物传感仪或高效液相色谱仪检测葡萄糖含量，当葡萄糖含量＜1%时，结束发酵，回收酵母，收集滤液备用。测得滤液可溶性固形物浓度为20.17%，pH为4.33，电导率为1730μS/cm。高效液相色谱仪检测发酵后的木糖母液中葡萄糖纯度0.37%，木糖纯度72.17%，L-阿拉伯糖纯度17.34%。

2.4 脱色

影响活性炭脱色能力的因素主要有：接触时间、温度、溶液浓度、活性炭用量。木糖母液的脱色是活性炭固体吸附作用，吸附和解吸是一个动平衡。母液浓度适当时，15～20min吸附即可达到平衡，1h后基本很少吸附，所以母液脱色的时间不要超过1h。温度是影响脱色的重要因素，为了降低溶液的粘度和加快分子的扩散速度，脱色都在加热的情况下进行。母液的活性炭脱色过程，在40～100℃时吸附的色素和温度成正比，但在40℃以下，不成直线关系。温度过高会破坏木糖分子，使糖分解和焦化，反而生成色素。

经过正交实验优化出最佳参数：按滤液重量的0.5%添加粉末活性炭，80℃，保温30min，抽滤真空过滤，得到脱色液。测得脱色液总可溶性固形物浓度为19.98%，pH4.24，电导1741μS/cm，透光度91.37%。

2.5 离子交换

阳离子交换树脂利用提供氢离子（H+）与母液中的钙（Ca2+）、镁（Mg2+）和钠（Na+）等杂质阳离子进行交换，树脂上的氢离子进入母液中，母液中的杂质阳离子则被吸附在树脂上；阴离子交换树脂利用阴离子交换树脂提供氢氧根离子（OH－）与母液中的硫酸根（SO42－）、氯根（Cl－）和有机酸根等杂质阴离子进行交换，树脂上的氢氧根离子进入母液中，母液中的杂质阴离子则被吸附在树脂上。从树脂上交换入母液的氢离子和氢氧根离子则结合为水。经试验得出最佳的离交顺序为：脱色液经过离子交换柱进行净化处理，离子交换顺序为弱阴离子交换树脂柱-强阳离子交换树脂柱-强阴离子交换树脂柱，测得离子交换后料液的重量25.3kg，可溶性固形物浓度为 16.2%，透光 100%，电导 4.3μS/cm，pH=6.8。

2.6 浓缩

进入连续色谱分离系统的母液浓度对分离效果影响明显。试验以分离效果为指标，确定了最佳进料浓度为44.12%。浓缩参数：温度80℃，转速25r/min条件下，将离子交换后的料液浓缩至折光44.12%。测得浓缩液的重量为7.61kg。高效液相色谱仪分析浓缩后的母液中木糖纯度为72.25%，L-阿拉伯糖纯度为17.49%。

2.7 连续色谱分离系统

以PCR-642 Ca2+树脂为固定相，纯水为流动相，将浓缩液泵入连续色谱分离移动床中，分离温度为60℃，单柱装树脂量为800mL，20根柱子树脂总装填量16L，树脂柱10.7min转动一次，树脂柱转到速率为214r/min。探讨Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区、Ⅳ区流量、进料流速、进料浓度等操作条件对连续移动床色谱分离效果的影响。试验采用了3个工艺条件，得出了不同的结果，分离操作条件和试验结果见表1。

表1 连续色谱分离系统操作条件和试验结果

经过3次工艺条件对比，得出结果：当进料可溶性固形物浓度为44.12%、进料流速10.0mL/min，木糖流出时的流速为15.0mL/min，L-阿拉伯糖的流速为13.0mL/min，补水流速18.0mL/min。1～5号Ⅰ区流速为73.0mL/min，6～10号Ⅱ区流速为 60.0mL/min，11～15号Ⅲ区流速为 70.0mL/min，16～20号Ⅳ区 57.0mL/min时，从柱5的出口收集的L-阿拉伯糖组分溶液中L-阿拉伯糖的纯度90.41%，其阿拉伯糖相对于进料中的阿拉伯糖得率为93.69%，从柱15的出口处收集的木糖组分溶液中木糖的纯度92.07%，其木糖相对于进料中的木糖得率为92.12%。称量L-阿拉伯糖组分溶液重量6.494kg，手持式折光仪检测其可溶性固形物含量为9.37%，木糖组分溶液重量为11.67kg，可溶性固形物含量为20.79%。

2.8 浓缩、结晶

2.8.1 L-阿拉伯糖组分的浓缩、结晶 将收集的L—阿拉伯糖组分溶液通过0.22μm微膜过滤，蒸发浓缩至可溶性固形物浓度为83%，测得糖浆重量为0.731kg，导入立式结晶器中，设定降温幅度2.5～3.5℃，进行循环水冷却降温，观察糖浆状态，当起晶时添加晶种，设定养晶时间7h，更改降温幅度为1℃/h，设定降温总时间40h，适度调节转速12r/min，当降至35℃左右时，结晶结束，得到的物料外观为白色（浅黄色）粘稠晶体悬浮膏状物，经三足离心机分离、干燥工序得到L-阿拉伯糖成品。烘干后的L-阿拉伯糖外观是洁白无暇、流动性好、结构松散的结晶性粉末，称得重量0.475kg，阿拉伯糖晶体相对于甘蔗叶提取木糖后的母液来说，得率为5.5%。L-阿拉伯糖产品色谱图见图2，高效液相色谱色谱分析L-阿拉伯糖成品纯度为99.93%。

2.8.2 木糖的回收 将L—阿拉伯糖同样步骤得到的糖浆，导入立式结晶器中测得重量为2.92kg，其它步骤类似于L—阿拉伯糖，适度调节转速15r/min，当降至35℃左右时，结晶结束。最后经三足离心机分离、干燥工序得到结晶性粉末。D-木糖烘干后，测重量为1.87kg，结晶出来的D-木糖晶体相对于甘蔗叶提取木糖后的母液来说，得率为22%。D-木糖产品色谱图见图3，经高效液相色谱检测木糖晶体纯度为99.95%。

图2 高效液相检测最终结晶的L-阿拉伯糖产品色谱图

图3 高效液相检测最终结晶的D-木糖产品色谱图

3 结论

以硫酸为酸化剂水解蔗叶，硫酸浓度1.2%、固液比1∶8、水解时间120min、水解温度123℃，离心后的水解液经过脱色、离子交换、浓缩、结晶等多步分离纯化工序，制备出外观洁白、晶体均匀一致、流动性好的木糖晶体，产品得率为7.14%，经高效液相色谱检测，木糖产品的纯度为99.93%，符合GB/T 23532-2009的要求。利用连续色谱分离系统（Septor IX）分离蔗叶提取液的木糖结晶母液，以钙型树脂为分离剂，纯水为洗脱液，分离温度为60℃，树脂柱转到速率为214r/min，浓缩液进料流速10.0mL/min，木糖流出时的流速为15.0mL/min，L-阿拉伯糖的流速为13.0mL/min，补水流速18.0mL/min。1～5号洗脱区流速为73.0mL/min，6～10号二级分离区流速为60.0mL/min，11～15号一级分离区流速为70.0mL/min，16～20号水回收区57.0mL/min。L-阿拉伯糖和D-木糖得到了最佳分离，组分纯度分别达到90.41%和92.07%，组分得率分别为93.69%和92.12%。分别结晶后，高效液相色谱分析L-阿拉伯糖成品纯度为99.93%，木糖产品纯度为99.95%。甘蔗叶木糖母液中结晶出来的阿拉伯糖晶体相对于母液来说，得率为5.5%；甘蔗叶木糖母液中结晶出来的木糖晶体相对于母液来说，得率为22%。

以每年处理1万吨甘蔗叶木糖母液计算，干物质含量在6000t，其中木糖含量在3600t，阿拉伯糖在800t，可回收高纯木糖2200t，阿拉伯糖550t。按木糖2.5万元/t、阿拉伯糖10万元/t计算，再加上母液的创收，最少可收益1.1亿元。