关于BnTR1基因抑制不同分化程度的肿瘤细胞增殖的初步探讨

向俊蓓 万谦

摘 要：为研究耐热基因BnTR1对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用，构建BnTR1条件表达载体，瞬时转染4种不同分化程度的肿瘤细胞。Western blot检测结果显示BnTR1的表达水平在几种肿瘤细胞中相近；MTT检测结果显示HGC和AGS的细胞增殖受到抑制，抑制作用HGC > AGS，而HT-29和MCF-7的细胞增殖不受到抑制。推断BnTR1对于分化程度低的肿瘤细胞增殖有抑制作用，而对于分化程度高的肿瘤细胞的增殖无明显抑制。

关键词：BnTR1 肿瘤启动子 肿瘤细胞的分化程度

中图分类号：S853.53 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）3（a）-0000-00

BnTR1基因（GU204975.1）来源于甘蓝型油菜 [1]，在植物中的功能包括抗热胁迫、抗盐胁迫等[1-2]。研究发现BnTR1对人宫颈癌细胞Hela和人肺癌细胞A549的增殖具有抑制作用，该抑制作用可以与抗癌化学药物顺铂cisplatin对Hela细胞和A549细胞的增殖抑制作用协同[3]。进一步研究发现，BnTR1编码一种泛素系统的E3连接酶，能对多种蛋白质包括某些转录因子进行泛素化[1，3-5]； BnTR1发挥抗胁迫功能和抑制肿瘤细胞增殖的功能，必须有其N端蛋白质结构中的RING结构域的存在[1，5]。由于人肿瘤细胞按不同标准可以分成许多不同类型，包括按分化程度的不同，可以大致划分为未分化、低分化和高分化，而其恶性程度的排序是：未分化>低分化>高分化。同时，不同分化程度的肿瘤细胞对于干预作用的反应是有差异的。因此，BnTR1能够抑制人肿瘤细胞增殖的特性值得深入研究。

基于此目的，研究中构建BnTR1条件表达载体，瞬时转染多种肿瘤细胞（人胃癌细胞HGC（未分化肿瘤细胞）、人胃癌细胞AGS（低分化肿瘤细胞）、人结肠癌细胞HT-29（高分化的肿瘤细胞）、人乳腺癌细胞MCF-7（高分化的肿瘤细胞））后，分别进行Western blot检测和MTT检测，分析TR1表达与肿瘤细胞的增殖表现的联系。

1 实验材料和方法

1.1 条件表达载体构建

（1）全基因合成人肿瘤基因c-ErbB-2的启动子序列，在5末端加上限制性内切酶AflII的酶切位点和保护碱基，同时在3末端加上限制性内切酶BamHI的酶切位点和保护碱基。利用基因克隆技术，将合成的全基因序列整合到pcDNA 3.1（+）上的AflII和BamHI的酶切位点之间，备用；高保真PCR酶扩增BnTR1全cDNA片段，并且分别在5端和3端加上BamHI和EcoRI序列和保护碱基，同时在5端BamHI的位点后加入蛋白质片段标记Flag tag，备用；

（2）利用基因克隆技术，拼接前述备用DNA片段，构建目标载体pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1。扩增质粒中插入BnTR1片段；测序验证序列正确性。

1.2 肿瘤细胞瞬时转染

分别培养肿瘤细胞包括HGC（未分化）、AGS（低分化）、HT-29（高分化）、MCF-7（高分化），并进行质粒pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的瞬时转染[7]：每种处理6孔重复，质粒pcDNA 3.1（+）做为对照；

1.3 Western blot检测

收获转染BnTR1的细胞和对照细胞并分别提取蛋白质混合物，Western blot[8]检测BnTR1的表达。使用兔抗BnTR1血清（自制抗血清）和兔抗人Beta-actin的一抗（中杉金桥，中国），小鼠抗兔的带辣根过氧化物酶（HRP）的二抗（中杉金桥，中国），ECL溶液购自碧云天公司。

1.4 MTT法检测肿瘤细胞的增殖

瞬时转染72小时后，使用MTT法[9]检测肿瘤细胞的增殖情况。使用MTT原液（0.5 mg/ml）（Sigma Inc.，USA）；二甲基亚砜DMSO（Sigma Inc.，USA）；

检测波长为570nm，参比波长为655 nm。

1.5 数据分析

每种条件获得6个OD570nm的数据，去除最高值和最低值，分析中分别对比转染pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的实验组和转染pcDNA 3.1（+）的对照组，使用软件SPSS 19.0进行独立样本t检验，比较实验组和对照组的细胞数量均值。

2 结果

2.1 载体构建与转染

测序结果显示BnTR1条件表达载体构建成功，Western結果显示瞬时转染后，BnTR1的蛋白质表达水平在HGC、AGC、HT-29和MCF-7中相近。

2.2 不同肿瘤细胞的增殖情况

HGC和AGS细胞的增殖受到BnTR1的瞬时转染的显著抑制（P = 0.03和P = 0.02），抑制率分别是17%和10%；而HT-29和MCF-7细胞的增殖未受到BnTR1的瞬时转染的显著抑制（P = 0.81和P = 0.39）。

3 讨论

研究中选择肿瘤基因c-ErbB-2的启动子，c-ErbB-2是一种肿瘤基因，具有在肿瘤细胞中高表达的特点。结果表明不同肿瘤细胞经过瞬时转染后，BnTR1的表达水平相近，而不同肿瘤细胞对于瞬时转染的反应性有差异。表达质粒对于处于未分化程度的HGC和处于低分化程度的AGS的增殖能限制抑制，而对高分化程度的HT-29和MCF-7的增殖不抑制，分化程度越低，BnTR1的抑制作用越显著。有文献报道BnTR1能抑制Hela和A549细胞的增殖[5]，而Hela和A549均为分化程度低的肿瘤细胞，故本研究结论为BnTR1对肿瘤细胞增殖的抑制功能与细胞分化程度的相关性提供了新的支撑数据。

参考文献

[1] Liu ZB， Wang JM， Yang FX， Yang L， Yue YF， Xiang JB， Gao M， Xiong FJ， Lv D， Wu XJ， Liu N， Zhang X， Li XF， Yang Y. A novel membrane-bound E3 ubiquitin ligase enhances the thermal resistance in plants. Plant Biotechnol.J.，2014，12（1）：93-104.

[2] 陈彩丽，曹昊昊，樊莉娟，等.过量表达BnTR1油菜对多种逆境的抗性分析.四川大学学报（自然科学版），2017，54（1）：215-220.

[3] Qian Wan， Zhibin Liu， Wenzhen Peng， Jianmei Wang， Xufeng Li， Yi Yang. BnRCH gene inhibits cell growth of Hela cells through increasing the G2 phase of cell cycle.Human Cell，2011，240：150-160.