熟地黄多糖联合同步放疗对鼻咽癌增殖转移的影响研究*

李 哲，刘树佳，翁玉玲，陈进杰，陈加家

1.广东省东莞市万江医院(东莞523000)，2.广东省东莞市人民医院(东莞523000)

主题词 鼻咽肿瘤/治疗 熟地黄 放射疗法

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方局部地区和东南亚发病率较高的恶性肿瘤。患者鼻咽局部(多位于鼻咽腔侧壁)表现为细胞病理学的改变，从而影响到病变部位的解剖结构，该病患者往往并不适合手术治疗[1-3]。熟地黄多糖(Rehmanniae glutinosa polysaccharide，RGP)是熟地黄的主要有效成分之一，可以影响TNF-α JAK/STATs信号通路调控基因，调控鼻咽癌细胞TNF-α、STAT3表达，进而展现抗肿瘤活性，促使鼻咽癌细胞凋亡，下调其迁移活性的作用[4]。为了探究熟地黄多糖联合同步放疗对鼻咽癌增殖转移的影响，特进行了临床对照研究，现报道如下。

对象与方法

1 研究对象 2016年8月至2017年11月期间，随机抽取门诊中符合研究要求的患者160例。所有患者均已签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理委员会的批准。其诊断、纳入和排除标准具体如下。诊断标准：符合中国抗癌协会制定的鼻咽癌诊断标准。纳入标准：所有患者预期生存期在6个月以上；年龄18岁以上；患者入院初未接受过化疗、放疗；无精神疾病可积极配合治疗有良好依次性；对治疗用药无相关禁忌证、明显过敏反应；KPS评分大于等于70分[5-7]。排除标准: 经检查发现、其他恶性肿瘤，曾接受化疗、放疗、靶向药物治疗，患者病灶出现转移，女性患者有妊娠、哺乳现象，未签署知情同意书，无法良好配合、依从性差者。排除标准：排除合并有心脏病、心功能障碍或合并有其他消耗性疾病者；排除妊娠或哺乳期患者；已经发生远处转移的患者；排除合并有其他恶性肿瘤病史的患者；依从性不强，不按照试验要求进行治疗及病情观察者；有严重肝肾功能不全的患者。

2 分组及治疗方法 根据患者入院时间单双日进行1∶1匹配，均分为对照组和实验组，每组均为80例患者，其具体治疗方法如下。①对照组(顺铂单药进行同步放疗)，具体根据NCCN指南推荐顺铂周方案同步放化疗。具体方法如下：入院后使用CT扫描、定位患者放疗区域，结合MRI影像(或PET-CT)标记肿瘤靶区(GTVnp、颈部淋巴转移灶(GTVnd)、高危临床靶区域(CTV1)、低危临床预防照射区(CTV2)。患者取仰卧位，每日1次使用瓦里安生产直线加速器进行放射治疗，其中肿瘤靶区剂量为70 Gy，颈部淋巴转移灶剂量为68 Gy，临床靶区1、靶区2 剂量分别为62 Gy、52 G y，4次/周，累积放射30次左右[8-10]。②实验组(同步放疗基础上使用熟地黄多糖进行联合治疗)：在对照组中同步放疗基础上使用熟地黄多糖(每天服用熟地黄多糖提取物，剂量为5 g，每次加水中服用)进行联合治疗[11]。

3 观察项目 患者入院初进行基本情况(性别、临床分期、病理类型、年龄、病程等)的数据采集，化疗前后进行相关指标的检测，化疗后评估临床疗效，具体内容包括如下几点。①CNE细胞生长抑制率：采用MTT法检测CNE细胞的增殖抑制率，将细胞悬液计数后按每孔(10×10/ml)细胞接种于96孔板，每孔加入10 μl MTT试剂(5 mg/ml)继续培养4 h后移出。弃上清液，每孔加入160 μl DMSO在微量振荡器上振荡大约12 min，直至完全溶解。用酶标仪检测吸光度，空白组调零，记录各组检测结果，按照公式细胞抑制率(%)=(1-实验组值A490/对照组值A490)×100%。实验重复5次，取平均值[12-15]。②Bcl-2、Bax、Caspase-3 表达含量：抽取患者清晨空腹静脉血，肝素抗凝，PBS 混匀稀释，制备细胞裂解液，加入等体积淋巴细胞分离液，低速离心后轻轻吸取淋巴细胞层液体， RPMI1640 洗涤5次。加入含10.0%FBS 的RPMI1640 培养液将细胞重悬，常温下培养10 h，去除贴壁细胞。采用荧光分光光度计分析法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3含量，检测条件为激发光波长380 nm，发射光波长为430～460 nm[14，16-18]。③淋巴细胞亚群：采用流式细胞仪测定淋巴细胞亚群，将分离纯化后的淋巴细胞收集并调整至(5× 106个/ml)，铺板后在常温下进行培养。加入等体积PBS溶液培养76 h，流式细胞仪测定CD80(+)、CD86(+)百分比。④临床疗效：分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)及进展(PD)，临床有效=CR+PR。完全缓解，肿瘤减少50.0%以上，用药治疗后症状明显改善，经检查各项生命体征稳定；部分缓解，肿瘤减少30%以上，且病症有改善，各项生命体征检查趋于平稳；稳定，肿瘤增加在15%以下或减少30%以下；进展，疾病症状未改善，病情加重治疗无效[19]。

4 统计学方法 采用SPSS l8.0统计学软件建立数据库并分析，多组计数资料的比较使用卡方检验(T<1的情况下使用精确概率)，正态分布计量资料的比较使用两个独立样本t检验的方法进行统计分析，检验水准取0.05，双侧概率。

结 果

1 两组患者基本情况比较 见表1。两组患者性别、临床分期、病理类型、年龄、病程指标差异没有统计学意义(P>0.05)。

表1 两组患者基本情况比较

2 两组患者治疗前后CNE细胞生长抑制率比较 见表2。两组患者治疗前后CNE细胞生长抑制率的比较，差异有统计学意义(P<0.05)，随着时间迁移，CNE细胞生长抑制率呈现显著上升趋势。治疗前和治疗1周后比较，两组患者CNE细胞生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)；治疗4周和治疗8周后比较，CNE细胞生长抑制率差异有统计学意义(P<0.05)，实验组CNE细胞生长抑制率显著高于对照组。

3 两组患者治疗前后Bcl-2、Bax、Caspase-3 表达含量比较 见表3。两组患者治疗前后Bcl-2、Bax、Caspase-3 表达含量差异有统计学意义(P<0.05)，随着时间迁移，Bcl-2表达含量呈现显著下降趋势，Bax、Caspase-3 mRNA表达含量呈现显著上升趋势。治疗前和治疗1周后比较，两组患者Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达含量差异无统计学意义(P>0.05)；治疗4周和治疗8周后比较，Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达含量差异有统计学意义(P<0.05)，实验组Bcl-2表达含量显著低于对照组，Bax、Caspase-3 mRNA表达含量显著高于对照组。

表2 两组患者治疗前后CNE细胞生长抑制率比较

表3 两组患者治疗前后Bcl-2、Bax、Caspase-3 表达含量比较 (光密度值)

4 两组患者治疗前后CD80和CD86阳性率比较 见表4。两组患者治疗前后CD80和CD86阳性率的比较，CD80和CD86阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，随着时间迁移，CD80和CD86阳性率呈现显著下降趋势。治疗前和治疗1周后比较，两组患者CD80和CD86阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；治疗4周和治疗8周后比较，CD80和CD86阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。实验组CD80和CD86阳性率显著低于对照组。

表4 两组患者治疗前后CD80和CD86阳性率比较 [例(%)]

5 两组患者临床疗效比较 见表5。实验组临床疗效显著优于对照组(P<0.05)。

表5 两组患者临床疗效的比较 [例(%)]

讨 论

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是临床发病率高、且有地域性差异的恶性肿瘤，广东中西部地区是疾病的高发地区[11-13]。大量流行病学调查结果表明，该疾病其早期症状不明显，发现确诊时已是晚期，且伴有淋巴系统的转移。目前临床上，该疾病的治疗方式首选为放疗。放疗可使肿瘤不同程度的缩小，使癌细胞活力下降，使癌细胞增殖能力降低，从而控制疾病的发展，从而提高患者的生存率。但鼻咽癌放疗扔存在许多毒副作用，最典型的有口腔黏膜反应、骨髓功能抑制等等。因此，有学者提出，同步放疗、化疗可减少癌症的远处转移，减轻肿瘤组织负荷，改善局部血液循环，增加放射敏感度，从而提高治疗效果，延长患者寿命[14-16]。

本研究结果显示，两组患者治疗前后CNE细胞生长抑制率、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达含量、CD80和CD86阳性率差异显著，并且随着时间迁移，CNE细胞生长抑制率、Bax、Caspase-3 mRNA表达含量呈现显著上升趋势，Bcl-2表达含量、CD80和CD86阳性率也呈现显著下降趋势[17-18]。说明鼻咽癌患者采取针对性的同步放疗治疗方法，可以有效控制鼻咽癌患者肿瘤细胞的增殖，可能与同步放疗可以影响细胞信号转导通路、细胞周期，从而有效的诱导癌细胞的凋亡有关。

同时，治疗4周和治疗8周后比较实验组CNE细胞生长抑制率、Bax、Caspase-3 mRNA表达含量显著高于对照组。熟地黄被称为“壮水之主，补血之君”，是优良的补益延寿中药，具有滋阴补血、填精益髓的功效。熟地黄多糖(Rehmannnia glutinosa polysaccharide，RGP)作为熟地黄的有效成分之一，具有多方面药理作用，增强机体的造血功能、降血压、降血糖、抗氧化等[19]。有学者提出，熟地黄多糖对人体多个细胞凋亡的信号通路具有一定药理作用，而细胞凋亡的信号通路中的线粒体凋亡途径通常依赖Caspases家族的活化。比如本研究中的Caspase-3、Bcl-2蛋白对细胞凋亡过程的调控至关重要[20]。

研究还发现，实验组患者CD80和CD86阳性率显著低于对照组，细胞免疫在肿瘤免疫及其治疗过程中发挥非常重要的作用。其中CD80、CD86 均是T淋巴细胞的共刺激分子，CD80与其配体CD28 结合可诱导T 淋巴细胞的活化和增殖。还有研究指出，CD 86可以参与到初次B淋巴的细胞应答过程，具有信号的传导作用。综上，熟地黄多糖联合同步放疗对鼻咽癌患者癌细胞的增殖、转移具有明显的抑制作用，该联合治疗方式可以为抗鼻咽癌中成药的开发提供理论基础。