丁苯酞预处理对急性低压低氧小鼠记忆功能及海马乙酰胆碱含量的影响

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高原低压低氧环境对人体各器官均有影响，其中脑组织是最易受损的器官之一，低压低氧可导致认知功能受损，如注意力、感知能力和记忆力等[1-2]。Shi等[3]在低压低氧舱模拟高原的实验中，急性低压低氧8 h，小鼠的电迷宫测试成绩明显降低。有研究表明，乙酰胆碱(Ach)可能参与了高原低压低氧引起的脑功能损害病理生理过程[4]。动物实验结果表明，丁苯酞(dl-3 -n-butylphthalide， NBP)能提高缺氧小鼠脑组织抗氧化应激的能力，延长缺氧小鼠存活时间[5]。也有研究表明，NBP能作用于胆碱能神经系统，改善脑损伤后引起的记忆障碍[6]。本研究旨在观察NBP预处理对低压低氧小鼠Morris水迷宫试验潜伏期、平均速度以及海马组织中Ach含量和胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性的影响，为进一步开展NBP防治高原脑损害的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 NBP悬液：取NBP(纯品，由石药集团恩必普药业有限公司提供，批号051201)0.9 mL和Tween80 1.25 g置于250 mL量杯中，加蒸馏水至250 mL摇匀，备用。蒸馏水悬液：取Tween80 1.25 g置于250 mL量杯中，加蒸馏水至250 mL摇匀，备用。Ach测定试剂盒及ChAT试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。主要仪器：FLYDWC-IA型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州风雷公司)，超净工作台(上海博迅实业有限公司)，Morris水迷宫MT2000(成都泰盟)。

1.2 实验动物、分组及实验方法 SPF级健康成年雄性昆明小鼠(由新疆维吾尔自治区疾病控制中心提供)，体重19 g～23 g，按标准分笼饲养于兰州军区总医院实验动物科，实验动物许可证号SCXK(军)2002-015。实验前自由饮食，饲养室及实验室温度保持在(23～25)℃，湿度在40%～45%，适应性喂养1周后开始实验。适应性喂养期间对小鼠进行Morris水迷宫实验训练。根据末次训练逃跑潜伏期成绩，挑选成绩较好的42只小鼠进行试验。将42只小鼠随机分为3组(每组14只)：常压常氧对照组、低压低氧对照组和低压低氧实验组。低压低氧实验组：给予小鼠NBP悬液2 mL/kg灌胃，2次/日，5 d后将小鼠置于低压低氧实验舱内，按程序减压至预定海拔，持续8 h。低压低氧对照组：给予小鼠蒸馏水悬液灌胃，其他同低压低氧实验组。常压常氧对照组：除低压低氧实验舱内空气保持与周围环境相通外，其他同低压低氧对照组。于实验结束时，各组随机拿出7只小鼠进行Morris水迷宫实验，其余于实验结束时取海马脑组织进行Ach含量及ChAT活性测定。

模拟急性低压低氧实验方法：将小鼠置于低压低氧舱内，按100 m/min的减压速度达到预定海拔(6 000 m)，持续8 h后按同样速度增压至实验室环境气压水平。舱内温度、湿度与实验室环境一致，小鼠可在实验舱内自由饮食。

1.3 Morris水迷宫实验 在水池壁上标注A、B、C、D 4个入水点，将水迷宫等分成4个象限，利用计算机软件记录各组小鼠搜索平台的逃逸潜伏期时间及平均速度，表示小鼠的学习记忆能力。若小鼠60 s内找不到平台，则将其引导上平台，小鼠每搜索1次须在平台上休息至少15 s。实验在安静、光线柔和的房间内进行，水温控制在(22.0±0.5)℃。

1.4 海马组织Ach含量及ChAT活性测定 小鼠出舱后立即断头于冰台上迅速取海马组织称重，加入冰生理盐水制成10%的组织匀浆，将匀浆在4℃以下2 000 r/min离心10 min，取其上清，放入-20 ℃以下冰箱中保存备用。按Ach与ChAT活性检测试剂盒说明书进行测定。

2 结 果

2.1 小鼠Morris水迷宫实验结果 与常压常氧对照组比较，低压低氧对照组和低压低氧实验组的潜伏期明显延长，平均速度显著减慢(P<0.05或P<0.01)；与低压低氧对照组比较，低压低氧实验组的潜伏期显著缩短，平均速度显著增快(P<0.05)。详见表1。

组别n潜伏期(s)平均速度(cm/s)常压常氧对照组726．39±8．4424．91±4．61低压低氧对照组7 44．60±7．802) 7．69±4．332)低压低氧实验组7 35．97±4．491)3) 13．58±5．332)3) 与常压常氧对照组比较，1)P<0．05，2)P<0．01；与低压低氧对照组比较，3)P<0．05。

2.2 小鼠海马组织乙酰胆碱含量和ChAT活性实验结果 与常压常氧对照组比较，低压低氧对照组乙酰胆碱含量和ChAT活性显著降低(P<0.05或P<0.01)；与低压低氧对照组比较，低压低氧实验组的乙酰胆碱含量和ChAT活性显著升高(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

组别n乙酰胆碱(mg/g)ChAT活性(U/g)常压常氧对照组78．11±0．35 271．0±70．1 低压低氧对照组77．56±0．421)167．4±46．22)低压低氧实验组78．00±0．283)238．4±65．44) 与常压常氧对照组比较，1)P<0．05，2)P<0．01；与低压低氧对照组比较，3)P<0．05，4)P<0．01。

3 讨 论

Morris水迷宫可以反映鼠类空间学习记忆的形成和维持时间，定位航行试验测定动物获取经验即学习能力，逃逸潜伏期的长短代表学习能力的高低；空间探索试验测定动物记忆保持的能力，测量值增加或减少提示记忆保持能力增强或减弱[7]，在Morris水迷宫试验中模拟高原低压低氧环境可使小鼠寻找平台的潜伏期较正常对照组明显延长，小鼠的空间学习能力和记忆保持能力下降，对学习记忆行为具有损害作用[8]。本实验对小鼠空间记忆能力变化的观察显示，低压低氧可使小鼠逃逸潜伏期延长，平均速度减慢，说明低压低氧可导致实验动物空间记忆能力下降，这与以往的研究报道[9]一致。NBP预处理小鼠逃逸潜伏期较低压低氧对照组缩短，平均速度也较低压低氧对照组增加，说明NBP可以减轻急性低压低氧对小鼠空间记忆的损害。

海马是大脑边缘系统重要的组成部分，参与整合外界信息，与空间位置的学习及近期记忆中的情节记忆过程均关系密切，其结构完整性以及各种神经递质的相互作用均在认知形成的过程中起着重要作用，其中Ach的合成及含量与认知、学习及记忆功能的关系尤为密切[10]。Ach是存在于脑内的一种神经递质，对于神经信号传递有着重要的作用，同时也是海马赖以维持胆碱能系统正常运行的重要神经递质，参与学习、记忆等相关生理活动，当Ach含量增高时，神经传导功能就会增强，以致加快神经元间信息传递的速度，记忆能力也随之增强[11]，痴呆病人常伴随脑脊液Ach活性及含量的降低[12]。有研究提示丁苯酞可以抑制细胞凋亡，对海马起到保护作用，促进神经功能的修复，改善认知功能障碍。ChAT是催化合成Ach的限速酶，通过胆碱能受体发挥生物学效应，与Ach的分布平行，常作为研究胆碱能神经元的一项特殊指标，若ChAT的活性发生异常，则会引起Ach代谢失调，导致中枢胆碱能神经系统发生生化改变[13]。Muthuraju 等[14]将大鼠放置于低压低氧舱(模拟海拔6 100 m)，大鼠记忆功能下降伴随Ach下降，Ach活性增加和ChAT表达下降，表明胆碱功能失调参与了低压低氧导致的记忆功能障碍损害的过程。

本实验研究发现低压低氧可使小鼠海马Ach含量降低，同时伴随ChAT活性减低，这与Irimajiri等[4]的研究结果相一致。NBP的活性成分是dl-3-正丁苯酞，是人工合成的消旋体，其左旋体存在于芹菜籽中，可改善脑损伤后的微循环、能量代谢，减轻神经功能损伤，涉及脑损伤多个病理环节，对脑损伤具有良好的治疗作用[15]。本研究发现NBP预处理过的小鼠在低压低氧环境作用下，Ach含量及ChAT活性下降的幅度比未进行预处理的小鼠要小，说明NBP在低压低氧作用下可以增加Ach的含量及ChAT的活性。NBP预处理组与常压常氧组比较差异虽无统计学意义，但是Ach含量及ChAT活性有下降的趋势，扩大样本量、增强指标检测结果的稳定性可能会影响实验的结果。

NBP可减轻低压低氧引起的小鼠脑损伤，增加海马组织中Ach含量及ChAT活性，改善记忆状况，提示NBP在高原低压低氧环境下对脑功能有保护作用。