尼可地尔对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化及心肌细胞凋亡的影响

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Rubler等[1]于1972年发现，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种与糖尿病病人体内代谢紊乱有关的独特心肌病变，不伴有高血压、冠状动脉粥样硬化、心脏瓣膜病等心脏疾病。包括心肌细胞代谢紊乱、微血管病变引起的心脏病变。近年来研究表明，DCM对人类健康的威胁日益严重，是引起糖尿病病人死亡的重要合并症之一，病人生活质量也受到严重影响，因此，早期治疗对降低DCM病人死亡率有重要意义[2]。本研究观察钾离子通道开放剂尼可地尔对糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化及心肌细胞凋亡的影响，为糖尿病心肌病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠 40只雄性健康SD大鼠，军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2012-0004，体质量150 g～170 g，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要药物及试剂 尼可地尔购自中外制药株式会社、格列本脲购自天津太平洋制药有限公司，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、HE染色试剂盒、核酸末端标记法(TUNEL法)试剂盒、天狼星红染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器设备 Olympus BX53光学显微镜；罗氏全自动生化分析仪Cobas 8000 c702。

1.4 糖尿病心肌病大鼠模型的建立， 以健康的SD雄性大鼠8只作为正常对照组(A组)，另取健康的SD雄性大鼠32只作为实验组，将实验组大鼠随机分为4组：糖尿病心肌病模型组(B组)、尼可地尔干预组(C组)、格列本脲干预组(D组)、尼可地尔+格列本脲干预组(E组)，每组8只。A组给予普通饲料喂养6周，B组、C组、D组、E组大鼠均予高脂高糖饲料(10%猪油、蔗糖20%、2%胆固醇、1%胆盐、67%普通饲料)喂养6周后，给予腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素(溶于0.1 mol/L pH4.2的枸橼酸缓冲液中，3 d后，禁食12 h，观察大鼠出现多尿、多饮、多食且尾静脉取血测血糖值>16.7 mmol/L者成模[3-5]。继续喂养，第8周开始，实验组分别予不同的干预，B组干预措施为连续28 d 生理盐水4 mL/kg灌胃1次/日，C组为连续28 d尼可地尔 10 mg/kg灌胃1次/日，D组为连续28 d格列本脲 5 mg/kg灌胃1次/日， E组为连续28 d尼可地尔10 mg/kg 1次/日+格列本脲5 mg/kg灌胃1次/日。

1.5 制备组织标本及观察生化指标 12周后，每组大鼠均腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，心脏取血用于化验各项生化指标。用生理盐水反复冲洗迅速取出完整新鲜心脏，滤纸吸干，称重，分离左心室，浸入甲醛中，24 h后石蜡包埋。用HE染色法观察心肌组织学变化及纤维化程度，TUNEL法观察心肌细胞凋亡指数、天狼星红染色法观察Ⅰ型/Ⅳ型胶原蛋白比例。罗氏全自动生化分析仪Cobas 8000 c702测定血糖、血脂水平，包括空腹血糖(FBG)、 总胆固醇(TG)、三酰甘油(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。采用己糖激酶法测定血糖情况，采用常规酶法测定TG和TC，采用直接法测定HDL-C 和 LDL-C。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 对照组大鼠饮食、饮水量正常，尿量正常，毛色鲜亮，精神尚佳，情绪稳定，反应灵敏；实验组大鼠均出现不同程度的多食、多饮、多尿，且有毛色枯黄、体形消瘦、烦躁、嗜睡的症状。

2.2 各组大鼠生化指标结果比较(见表1)

mmol/L

2.3 HE染色观察心肌纤维化程度 A组可见心肌纤维走行正常，心肌细胞呈规整排列，核居细胞中央，呈完整的圆形或椭圆形，胞浆均匀着色，间质及微血管也未见异常；B组、C组、D组、E组心肌纤维走行紊乱，可见坏死、断裂的心肌纤维，核裂解及核溶解也有不同程度地出现，心肌细胞呈空泡状，界限不清，同时可见炎细胞浸润、纤维细胞增生。其中 B组最为明显，C组较其他各组纤维细胞增生程度最不明显。详见图1。

图1 HE染色后心肌纤维化程度(HE×200)

2.4 TUNEL法观察心肌细胞凋亡指数 正常心肌细胞核在光镜下为蓝色，形态、大小较为一致；而凋亡的心肌细胞核可见核浓缩、聚集，为黄褐色，着色深浅不一，大小不一。各组间心肌细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2、表2。

组别n凋亡指数A组80．89±0．01B组80．92±0．03C组80．92±0．01D组80．93±0．01E组80．97±0．00

图2 TUNEL法观察心肌细胞凋亡指数

2.5 天狼星红染色法观察Ⅰ型/Ⅳ型胶原蛋白比例 光镜下可见Ⅰ型胶原纤维呈亮红色，Ⅳ型胶原纤维呈绿色。对照组大鼠有较均匀、纤细的胶原纤维分布，还可见大部分变窄的心肌细胞束间隙。实验组大鼠心肌横切面，可见胶原纤维粗大、紊乱，排列成网。而尼可地尔干预组胶原纤维较其余模型组分布均匀。详见图3。

图3 天狼星红染色法观察Ⅰ型/Ⅳ型胶原蛋白比例

3 讨 论

糖尿病心肌病是一种与冠心病、瓣膜病无关的、独立的特异性心肌病变。近年来研究表明，糖尿病心肌病的发病机制包括多个非常复杂的方面，如心肌细胞代谢障碍、心肌微血管病变、胞内Ca2+调节异常、细胞因子异常、氧自由基异常等[6]。目前大多数研究结果表明，早期DCM主要由以下几方面引起，包括：心肌能量代谢紊乱、高血糖导致的心肌细胞凋亡、线粒体损伤等[7-8]。文献报道，DCM会发生一些病理改变，如心肌肥大、微血管变窄、胶原结构改变、心肌纤维化[9]及心肌细胞凋亡。本研究结果表明，B组、C组、D组、E组与正常对照组(A组)相比，心肌结构发生了一定的病理组织学改变。

本研究先以高脂高糖饮食喂养实验组大鼠，造成其糖脂代谢异常，再给予大鼠腹腔注射STZ，结果显示实验组与对照组相比，FBG、 TG、TC、LDL-C均偏高，表明实验组大鼠符合2型糖尿病特点，有胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱；而机体高血糖状态可使心肌细胞Na+-K+-ATP酶的活性受到抑制，导致细胞内Ca2+蓄积[10]，出现舒张功能障碍。而KATP通道可被尼可地尔激活，使K+导电性增强，从而K+外流增多，膜电位超极化，导致电压依赖性Ca2+通道的关闭，减少Ca2+的内流，使Na+-Ca2+交换增加，降低了心肌细胞内Ca2+浓度[11]，起到了心肌保护作用。

尼可地尔是分子式中含有硝酸基的ATP敏感的KATP开放剂。它一方面通过直接激活cGMP，使得细胞膜和线粒体膜KATP的开放增加，具有舒血管的效应，从而增加状动冠脉血流，改善血管痉挛和微循环；另一方面还可以使钾离子存留到线粒体内，抑制了钙离子内流，使细胞内钙离子浓度明显降低，进而起到舒张血管、改善冠状动脉血流的功效，很大程度上减轻了心脏前后负荷[12-16]，同时在抗心肌细胞凋亡、增强缺血预适应方面，尼可地尔也有一定作用。本实验研究结果显示：尼可地尔干预组天狼星红染色法观察可见胶原纤维分布均匀，HE染色法可见心肌纤维化程度较糖尿病心肌病模型组轻，表明尼可地尔具有减轻糖尿病大鼠的心肌损伤作用。本研究中尼可地尔组与其他各组相比，心肌细胞凋亡指数之间的差异并无统计学意义，分析可能的原因有：①用于实验的样本量不够大，故有待观察较大样本量的细胞凋亡指数。②与尼可地尔的剂量较小有关，抗心肌细胞凋亡效果不显著。③实验后期大鼠老龄化，心肌细胞本身也发生了凋亡。

本研究表明，尼可地尔可减轻糖尿病大鼠的心肌损伤及心肌纤维化，可为早期糖尿病心肌病的心肌保护提供依据，有重要的临床应用价值。