甘蓝SNP标记开发及主要品种的DNA指纹图谱构建

李志远，于海龙，方智远，杨丽梅，刘玉梅，庄木，吕红豪，张扬勇

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

0 引言

【研究意义】结球甘蓝（Brassica oleraceaL. var.capitata）简称甘蓝，在中国各地广泛栽培。截止至2015年，中国审（鉴、认）定或登记的甘蓝品种共计 247个[1-5]，其中大部分为一代杂种。近年来，市场上的甘蓝品种不断增多，种植面积不断增大。但是，在种子市场上同名异物及同物异名的情况时有发生，甚至一些不合格种子混入市场，造成巨大的经济损失。因此，对品种进行快速准确鉴定，对于假种辨别和产权纠纷具有重要作用。【前人研究进展】早期的品种鉴定手段主要依赖于形态学鉴定，这种方法耗时较长且易受环境影响。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现为品种鉴定提供了新的手段。分子标记技术具有周期短、不受环境条件影响、可进行高通量测试分析等优点，已经在品种鉴定、种子纯度鉴定等方面得到广泛应用[6-7]。随着生物技术的进步，陆续有基于RFLP、AFLP、SSR、SNP等分子标记用于DNA指纹图谱的构建。其中，SNP分子标记是国际植物新品种权保护联盟（UPOV）BMT分子测试指南中构建DNA指纹数据库的推荐标记之一[8]。相对于传统标记，利用SNP标记构建的指纹图谱具有数量多、分布广泛、稳定性高、易于快速且高通量分型的特点[9-10]。分子标记技术在甘蓝品种指纹图谱构建中得到了广泛的应用，薄天岳等[11]通过SRAP、RAPD 2种分子标记方法，构建了甘蓝品种‘争春’、 ‘寒光2号’及其各自亲本的DNA指纹图谱，并将其用于种子纯度鉴定。宋顺华等[12]利用AFLP标记对来自全国的44份甘蓝品种进行分析，并构建了其指纹图谱。陈琛等[13]利用5对SSR标记构建了6个秋甘蓝品种及其亲本共18份材料的指纹图谱。王庆彪等[5]利用20对SSR标记构建50份中国甘蓝代表品种DNA指纹数据库并阐述了甘蓝SSR-DNA指纹鉴定的应用和技术流程。【本研究切入点】目前，甘蓝品种鉴定中常用的指纹图谱是基于AFLP、SSR等分子标记。但是，传统AFLP、SSR指纹图谱存在标记数量有限、检测位点少，位点的突变率高、对变异反应比较敏感等缺点。SNP标记作为第三代分子标记，具有数量多、分布广泛、二态性、易于快速且高通量的进行基因分型等优点。SNP标记已经在玉米[14]、油菜[15]、香菇[16]等作物指纹图谱构建中得到应用，但在甘蓝类蔬菜中尚未有基于 SNP标记的指纹图谱。【拟解决的关键问题】本研究基于甘蓝高代自交系的重测序数据开发SNP标记，利用KASP技术对主要甘蓝品种进行基因分型[17]，根据分型结果筛选筛选在染色体上均匀分布、多态性信息较高的SNP位点作为核心标记，并利用核心SNP标记构建甘蓝品种指纹图谱，为甘蓝品种真实性、特异性鉴定提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2016年12月至2017年5月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝遗传育种实验室进行。

指纹图谱构建：从国内主要育种单位搜集（鉴定、登记）市场上推广的主要代表品种59个（电子附表1）。

核心SNP标记验证：在上述59个主要甘蓝品种中挑选15个已推广的品种，及5个未推广的新组合。每个品种或组合取3粒种子，将种子混合构成人工虚拟混合群体。

1.2 DNA提取

将59个主要代表品种的种子放于培养皿中，采用纸上发芽，放置于25℃恒温培养箱中，催芽5—6 d。取子叶和下胚轴，每份样品中取若干个体，共计0.5 g，采用改良 CTAB法[18]提取 DNA，使用冷冻干燥机将样品DNA抽干后置于-80℃保存。

将人工虚拟混合群体种子混合催芽，然后按单个幼苗提取DNA。

1.3 KASP标记开发及检测

对50个甘蓝高代自交系进行重测序，所测的自交系涵盖了不同茬口（春、秋、越冬）、不同熟性（早、中、晚）及不同球型（扁、圆、尖）的材料，具有很好的代表性。利用重测序数据与参考基因组（02-12）[19]进行比对，开发SNP位点。对获得的SNP位点按以下条件进行筛选：（1）位点的未测通材料数＜20；（2）多态性在40%—60%；（3）在染色体中均匀分布；（4）位点前后各50 bp不存在其他变异。对于筛选获得的SNP位点，截取其前后各50 bp序列，交由LGC公司开发设计KASP引物。

PCR反应体系（10.14 µL）为KASP Master mix 5 μL、KASP Primer mix 0.14 μL和模板DNA（20 ng·μL-1）5 μL。PCR反应条件为第一轮94℃ 15 min；94℃20 s，61—55℃ 60 s，10个Touch Down循环（每个循环降低0.6℃）；第二轮94℃ 20 s，55℃ 60 s，26个循环。使用荧光微孔板检测仪检测 PCR产物，用LGC公司开发的SNPviewer软件读取检测数据。所用KASP Master mix 购自英国 LGC公司，货号为KBS-1016-012。

1.4 数据处理

根据分型结果计算出各个标记的等位基因频率，然后利用软件PIC_Calc 0.6计算各标记的多态性信息含量（polymorphism information content，PIC），计算公式为PIC = 1-∑fi2，其中fi为i位点基因频率。依据SNP标记具有的二态性特点，将分型数据转化为二元编码数据，将野生型（与参考基因组一致）表示为（1，0），突变体表示为（0，1），将杂合基因型表示为（1，1），缺失碱基位点记为（999，999），对每份材料进行基因型统计，利用NTSYSpc2.1软件进行相似系数计算及基于UPGMA算法的聚类分析[15]。

1.5 核心SNP位点的挑选及其在品种鉴定中的应用

根据基因分型结果，筛选出多态性信息含量＞0.35、无基因型数据缺失、在9条染色体上均匀分布的SNP位点作为构建甘蓝品种指纹图谱的核心位点。

利用核心SNP标记位点，对人工构建的虚拟混合群体进行SNP标记分析，并与已有SNP-DNA指纹图谱进行比对，判定虚拟混合群体的60个样品的分型结果是否与指纹图谱数据库中相应品种对应。

2 结果

2.1 甘蓝SNP标记的开发

对50个甘蓝高代自交系进行重测序，平均测序深度为5×。将重测序数据与参考基因组02-12进行比对，共获得SNP位点2.54×106个。筛选位点多态性介于40%—60%、未测通材料数＜20的SNP位点，共获得2.59×104个。进一步筛选在9条染色体上均匀分布、位点前后各50 bp不存在其他变异位点的SNP位点，最终获得500个SNP位点用于下一步试验，平均每条染色体上55.6个。500个SNP位点中有442个成功转化为KASP标记，转化成功率为88.4%。

利用KASP平台对59个甘蓝品种进行基因型检测，442个KASP标记全部成功分型。在442个标记中，有25个标记的未分型材料数＞5，为保证结果准确性，在后续分析中将这25个标记去除。在59个甘蓝品种中，全部标记的杂合位点比例大于30%的品种有57个，占所有品种的96.6%（图1）。其中，品种‘豫生早熟牛心’的杂合位点比例最高，为 67.8%；‘秦甘78’杂合位点比例最低，为18.8%。所有SNP标记在全部品种中多态性信息含量（PIC）处于 0.12—0.38，PIC值大于0.35的位点占所有位点的63.5%，其中PIC值为0.37的位点最多，有157个（图2）。

2.2 核心SNP位点的挑选及DNA指纹图谱的构建

综合考虑基因分型结果，筛选PIC值大于0.35、无基因型数据缺失、在9条染色体上均匀分布的SNP位点作为构建甘蓝品种指纹图谱的核心位点，最终获得50个SNP位点用以构建主要品种的指纹图谱（表1）。50个核心SNP位点中，位点Bol2-56的PIC值最高，为0.38；位点Bol8-11的PIC值最低，为0.35；平均PIC值为0.36，表现为中度多态性。

将59个主要品种的核心位点分型结果转化为二元编码数据，得到主要甘蓝品种的指纹图谱（表2）。参考甘蓝SSR-DNA指纹鉴定技术流程，品种间差异位点数≥2则可判定为不同品种。利用50个核心SNP位点构建的指纹图谱，各品种间差异位点数均≥2，因此，利用该DNA指纹图谱可对甘蓝品种进行有效区分。

图1 417个SNP标记的多态性信息含量分布情况Fig. 1 Distribution of polymorphism information content in 417 SNP markers

图2 基于417个SNP标记的59个主要甘蓝品种的杂合基因型比例Fig. 2 Heterozygous genotype ratio of 59 main varieties based on 417 SNPs

2.3 主要甘蓝品种的聚类分析

根据50个核心位点的分型结果，利用NTSYS软件对59个供试品种进行聚类分析（图3）。结果表明，育成品种两两间的遗传相似系数为0.43—0.98。其中，‘秦甘 78号’与‘争春’的遗传相似系数最小，为0.43，二者之间存在41个差异标记，这说明二者亲缘关系最远。而‘中甘21’与‘中甘628’的遗传相似系数最大，为0.98，二者之间的差异标记仅有2个，说明它们的遗传背景很相似。分析‘中甘21’与‘中甘 628’的系谱发现，二者的父本完全相同，母本都是圆球春甘蓝材料。

在遗传相似系数0.60处，可将所有供试品种分为两大类群。第一大类群共包含33个品种，在遗传相似系数0.64处可划分为3个亚类，‘中甘8号’、‘晚丰’等11个品种为第1亚类；‘春丰’、‘博春’为第2亚类；第3亚类包含‘春甘2号’、‘争春’等在内的20个品种。第二大类主要为圆球或近圆球类型甘蓝，共25个品种，在遗传相似系数0.61处可划分为2个亚类，将其命名为第4亚类与第5亚类。其中，第4亚类包含21个品种；第5亚类包含5个品种。聚类分析的结果与供试品种的来源有很强的相关性，例如：山西省农业科学院育成的惠丰系列甘蓝、河南省

农业科学院育成的豫甘系列甘蓝、江苏镇江农业科学研究所育成的瑞甘系列甘蓝，上述单位培育的一系列甘蓝品种之间呈现较近的亲缘关系，聚类分析时聚在一起。结果表明，SNP聚类结果与供试品种的表型性状和地理来源相一致，能准确的反映供试品种的亲缘关系。

表1 用于构建指纹图谱的50对核心引物Table 1 The information of 50 core primers for fingerprinting

续表1 Continued table 1

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2.4 核心标记在品种鉴定中应用

通过人工构建的虚拟混合群体对DNA指纹图谱

的核心位点进行验证，利用50个核心SNP标记对虚拟混合群体进行基因分型检测，并与已构建的 DNA指纹图谱进行比对。基因分型结果显示：虚拟混合群体中来源于同一品种的3个样品其分型结果完全相同，这说明核心SNP标记具有较好的重复性。虚拟混合群体中有45个样品（15个品种）的分型结果与DNA指纹图谱中相应品种完全对应。剩余的15个样品（5个新组合），与指纹库中材料均表现出较大差异（差异位点数＞2），在指纹库中无对应品种。结果表明，利用50个核心SNP标记可实现对甘蓝品种真实性和特异性的有效鉴定。

表2 中国59 份主要甘蓝品种的SNP-DNA 指纹图谱数据库Table 2 SNP-DNA Finger-printing database of 59 main cabbage varieties from China

续表2 Continued table 2

续表2 Continued table 2

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图3 59个主要甘蓝品种的SNP聚类分析图Fig. 3 Cluster analysis dendrogram based on SNP for 59 main cabbage varieties

3 讨论

3.1 主要甘蓝品种的代表性

目前，中国甘蓝种植面积约90万hm2[20-21]，在蔬菜周年供应中占据重要地位。中国甘蓝品种选育开始于20世纪50年代、70年代以后得到快速发展。目前市场上审定推广的甘蓝品种大都为一代杂种，一代杂种的种植面积占总种植面积的90%以上[21]。

本试验中所选用的 59个甘蓝品种全为一代杂种。在59个甘蓝品种中，年推广面积曾达到1×104hm2以上[23]且目前还有大面积种植的品种就有十几个，如‘京丰一号’、‘8398’、‘中甘21’、‘晚丰’、‘庆丰’、‘中甘15’、‘中甘11’、‘春丰’、‘争春’、‘西园四号’等，这些品种占到国内甘蓝种植面积的 60%—70%[24]。本试验中所选的59个主要甘蓝品种涵盖了不同球型（圆球、扁球、牛心型）、不同栽培季节（春甘蓝、秋甘蓝、越冬甘蓝）及不同熟性（早、中、晚熟），这些品种具有广泛的代表性。

3.2 基于SNP位点构建DNA指纹图谱

DNA指纹图谱技术（DNA-Fingerprinting）是由英国科学家Jeffreys于1986年开发，具有快速、准确等优点，是鉴别品种、品系的有力工具，已广泛应用于很多作物的品种资源多样性和纯度鉴定研究，陆续将RFLP、AFLP、SSR、SNP等标记技术用于构建DNA指纹图谱。其中，SSR指纹技术由于其重复性好、简单易于操作、且大多数为共显性标记，常用于品种鉴定分析，已在水稻[25]、玉米[26]、柑橘[27]、甜瓜[28]等多种作物中得到应用。在甘蓝中，基于SSR标记已建立了50个代表品种的指纹图谱，并制定了 SSR分子标记法进行甘蓝品种鉴定的技术规程（标准号：NY/T 2473-2013）。但SSR标记在实际使用中也暴露出一些不足，如标记数量有限、检测位点少，位点存在一定的突变率、对变异反应比较敏感等。SNP指纹技术是继RFLP和SSR之后发展起来的第3代标记技术，具有数量多、分布广泛、稳定性高、易于快速且高通量地进行基因型分型等优点[8]。与 SSR相比，SNP是基于单核苷酸的突变，突变频率更低，遗传稳定性更高。SNP标记是构建 DNA指纹数据库的推荐标记之一，但是目前甘蓝中尚没有基于SNP标记的指纹图谱。因此，构建基于SNP标记技术的指纹图谱对于甘蓝品种特异性和真实性鉴别、种子纯度鉴定具有重要意义。

随着SNP检测技术的不断进步，SNP标记的检测成本也逐步降低。相对于SSR标记，目前高通量大样本的SNP标记检测已显现出优势。今后随着品种数量的增多、品种指纹图谱数据库的进一步丰富，高通量的SNP检测技术在新育成品种的真实性、特异性鉴定方面将具有非常广阔的应用前景。

3.3 利用核心标记构建SNP-DNA指纹图谱

指纹图谱核心标记的选择视物种基因组的复杂程度、标记类型、标记检测技术、品种数量等情况而定。匡猛等[29]利用36对SSR引物作为核心标记，构建了32个棉花主栽品种的指纹图谱。王立新[30]在小麦品种鉴定中提出使用21对核心引物、84对备用引物进行指纹研究。王庆彪等[5]使用 20对核心引物构建了 50个甘蓝品种的EST-SSR指纹图谱，利用其中8对多态性较好的引物便可将50个品种全部区分开。因此对于不同物种，构建指纹图谱的核心标记数量应视物种基因组复杂程度而定。SSR标记数量丰富、多态性高、呈共显性，可鉴别杂合子和纯合子，可用少量标记鉴别大量物种。与SSR标记不同，SNP标记虽然稳定性高但呈二态性，单个标记的多态性信息含量较低，鉴别相同数量品种所需要的标记数多于SSR标记。本研究中，筛选出了50个核心SNP位点用于主要甘蓝品种的指纹图谱构建，由于SNP标记的二态性，理论上每个标记可区分的杂交种数 N1=3，本研究中选取得50个标记可区分的最大杂交种数N=3^50=7.18×1023，出现相同指纹图谱的概率P=1.39×10-24。因此，理论上而言，利用50个核心SNP标记构建甘蓝主要品种的指纹图谱是完全可行的。

SNP-DNA指纹图谱的构建方式也与SNP检测方法有关。目前常用的SNP检测及分型的方法主要有以下几种，基于凝胶电泳检测的等位基因特异性PCR[31]、单链构象多态性[32]、酶切扩增多态性序列法[33]等；高通量自动化检测的直接测序法、DNA芯片技术[34]、竞争性等位基因特异性PCR[17]等。等位基因特异性PCR、酶切扩增多态性序列法等SNP检测方法由于其操作繁琐、准确率较低，不适用于构建指纹图谱。目前，利用 DNA 芯片技术是检测 SNP 的最常用方法，已在玉米[14]、油菜[15]等作物的指纹图谱构建中得到应用。利用 DNA芯片技术可直接进行指纹图谱构建，不需要进行核心标记筛选，但该方法制作DNA指纹图谱的成本较高。相比于DNA芯片技术，利用KASP技术进行SNP检测的成本较低，其成本与检测的SNP位点数呈正相关。从发展趋势来看，近年来随着甘蓝基因组重测序的陆续开展，越来越多的SNP标记得到开发，加上SNP标记相比SSR标记的一些优势，将来会更多地依赖于SNP标记进行品种的特异性、真实性鉴定。本研究中，利用KASP技术进行SNP检测并筛选出50个核心SNP位点用于构建59个主要甘蓝品种的指纹图谱，随着育种技术的发展、育成品种数量的增多，也有可能还需要增加 SNP标记，尤其是与重要农艺性状紧密关联的SNP标记，以更准确、高效地检测出品种的真实性、特异性。同时，希望可以为新品种保护授权提供前期的鉴定工作，利用指纹图谱对品种进行初步鉴定，最终结合田间表型鉴定判定品种的特异性、真实性。

4 结论

利用50份甘蓝高代自交系重测序数据进行比对，共开发2.54×106个SNP位点。将442个SNP位点成功转化为KASP标记，并从中开发出一套适用于中国甘蓝品种指纹图谱构建的核心SNP组合，构建了中国59个甘蓝品种指纹图谱数据库。通过人工构建模拟群体验证，证明核心SNP组合可实现对甘蓝品种真实性和特异性的有效鉴定。