周细胞在慢性脑血流低灌注血-脑脊液屏障损伤中的作用

曹丹丹 孙 静 白云飞 王 苗 郭晨佳 崔 静 李 良

(首都医科大学基础医学院病理系，北京 100069)

慢性脑血流低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 和血管性痴呆的重要发病危险因素，动脉硬化、心输出量减少、血压过高或过低等都是造成CCH的原因。CCH使脑组织能量代谢障碍，引起神经递质紊乱、氧化应激、神经炎性反应，导致神经元损伤和白质病变，从而引起认知功能障碍[1]。血-脑脊液屏障(blood brain barrier, BBB)是脑组织与血液之间的物质交换屏障结构，具有调节血液中营养物质、代谢产物、各种电解质出入脑组织，维持神经系统正常内环境的作用。BBB损伤可引起有毒物质聚集、炎性细胞因子和免疫细胞迁移至脑实质，引起脑组织炎性反应等一系列损伤。周细胞是BBB的重要组成成分之一，对于血管形成、控制脑血流量、维持BBB功能等都发挥着重要作用[2]。近些年来，周细胞在神经系统疾病中的作用逐渐引起人们的重视，而其在CCH时的变化尚未见报道。大鼠双侧颈总动脉结扎(two-vessel occlusion, 2-VO)模型是目前国内外公认的能够模拟人类CCH的动物模型[3-4]。本研究拟采用2-VO大鼠模型，探讨周细胞在脑低灌注BBB损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

小鼠CD31抗体 (谷歌生物公司); 小鼠PDGFRβ抗体 (美国Abcam公司)；FITC标记兔抗人纤维蛋白(原)抗体 (北京中杉金桥公司)；小鼠四型胶原抗体、人纤维蛋白原、CCK-8细胞活性试剂盒购于美国Sigma公司；Alexa Fluor 488/594 山羊抗小鼠IgG购于美国Invitrogen公司。

石蜡包埋机、轮转式切片机(德国Leica公司)；荧光显微镜(德国Leica 公司);小动物磁共振成像设备(德国Bruker 公司)；透射电子显微镜(日本日立公司HT7700)。

1.2 动物与分组

12周龄雄性Wistar大鼠，SPF级，购自北京维通利华动物供应中心，实验动物合格证号：SCXK京2002-0003。将大鼠采用数字表法随机分为4组: 对照组、3 d模型组、14 d模型组和30 d模型组，每组动物12只。

1.3 2-VO动物模型的制备

10%(质量分数)水合氯醛3×10-3mL/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定，常规消毒，行颈正中切口，分离双侧颈总动脉，模型组用丝线行双侧颈总动脉结扎[4]；对照组只做双侧颈总动脉分离不结扎，缝合切口。

1.4 脑血流量检测

应用7.0T磁共振动脉自旋标记( arterial spin labeling, ASL) 技术测定大鼠脑血流量(cerebral blood flow, CBF)[5]。使用 Pharma Scan 7.0/ 16US 磁共振成像系统，对所有大鼠行常规ASL序列扫描，选取感兴趣区，测量双侧顶叶深部皮质CBF值。

1.5 免疫组织荧光染色

大鼠灌注固定后行连续冠状位切片，厚25μm，根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱选取相同部位的冠状切面进行染色，一抗4 ℃过夜；二抗室温避光孵育，封片后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 大鼠脑周细胞原代培养

依照文献[6]报道的方法分离脑微血管段，用含10%(质量分数)FBS的高糖DMEM培养基37 ℃、5%(体积分数) CO2培养箱培养，至第10天后，胰酶消化、传代。体外实验采用3～10代周细胞。

1.7 CCK-8检测细胞增生活力

原代培养周细胞每孔5 000个接种于96孔细胞培养板，24 h后分别加入不同浓度纤维蛋白原，培养24 h后每孔加CCK8试剂10 μL，温育2 h后450 nm处测定吸光度(A) 值。实验重复进行3次。

1.8 电镜检测

动物处死后快速取下顶叶深部皮质，经固定、脱水、包埋、固化后，超薄切片机切片、饱和醋酸铀、0.5%(质量分数)柠檬酸铅染色，透射电镜观察，拍片。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 2-VO大鼠不同时期脑血流改变

ASL结果显示，与对照组相比，2-VO术后 3 d时顶叶皮质血流量为对照组的35%，2-VO术后 14 d时血流量为对照组的57%，2-VO 术后 30d时血流量为对照组的80%(图1)，2-VO模型大鼠大脑皮质处于持续血流低灌注状态。

2.2 BBB改变

纤维蛋白原免疫荧光染色结果显示，2-VO术后3、14和30 d时血管周围均有纤维蛋白原渗漏，并且随着时间延长纤维蛋白原血管外沉积逐渐增多(图2A)；电镜下观察，与对照组相比，脑慢性缺血后可出现血管基膜增厚、星形胶质细胞足突肿胀、血管外周围间隙致密物质沉积以及红细胞渗漏等(图2B)。2-VO模型不同时期均出现BBB损伤。

2.3 慢性脑血流低灌注对周细胞的影响

血管周细胞免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，2-VO术后 3 d周细胞数量开始增多，为对照组的1.5倍，14 d时周细胞数量增加到对照组的2倍，至术后30 d时有所下降，为对照组的1.4倍(图3A、C)；血管内皮免疫荧光染色结果显示，模型组各个时期深部脑皮质血管数量与对照组相比无明显变化(图3B、D)；采用不同浓度纤维蛋白原处理原代培养周细胞，CCK-8检测细胞的增生情况，与对照组相比，0.25 g/L纤维蛋白原对周细胞无增生或毒性作用，而0.5、1、1.5、2.5、5和10 g/L纤维蛋白原对周细胞均有促增生作用，在1 g/L 细胞活力最高，达到120%；20 g/L时周细胞出现明显死亡，细胞活力为对照组的75%(图3E)。

图1 脑血流改变Fig.1 Changes of CBF by ASL

*P<0.05vscontrol,***P<0.001vscontrol,n= 6；CBF: cerebral blood flow;ASL: arterial spin labeling；2-VO:two-vessel occlusion.

图2 大鼠大脑皮质血-脑脊液屏障改变Fig.2 BBB changes in different stages of 2-VO rat model

A: fibrinogen leakage in the cortex, COL4α for type IV collagen (red), fibrinogen (green); bar=75μm;B: electron microscopic image of BBB in the cortex;a: astrocytic foot;b: red blood cell leakage;c: vascular lumen;p: pericyte;Thinarrow: vascular basement membrane;Thickarrow: the dense deposit in the extravascular space; Bar=1μm (n=3);BBB：blood brain barrier；2-VO:two-vessel occlusion.

3 讨论

大鼠2-VO模型被广泛用于CCH损伤的研究，该模型中血管闭塞稳定且持久，脑灌注不足是全脑性的，不出现局灶性脑梗死。急性期CBF急剧下降至正常水平的35%～45%，由于Willis环的代偿作用，1周后开始逐渐恢复进入慢性期，至3个月时CBF仍维持在正常的80%左右，此期与老龄化及AD患者的脑血流变化最相似[3]。本实验结果为2-VO术后 3 d时顶叶皮质CBF为对照组的35%，2-VO术后14 d时CBF为对照组的57%，2-VO 术后 30 d时血流量为对照组的80%，此结果与文献[3]报道相一致。

图3 大鼠大脑皮质周细胞数量变化以及纤维蛋白原对周细胞增生的影响Fig.3 Number of pericytes in cortex and the effect of fibrinogen on pericytes proliferation

A: PDGFRβ+pericyte, bar=50 μm;B: CD31+endothelial cells, bar=100 μm;C: number of pericyte;D: vascular number;E: pericyte activity assay；*P<0.05,**P<0.01vscontrol,##P<0.05vs2-VO 14 d (n= 3);2-VO:two-vessel occlusion.

BBB主要由血管内皮细胞、周细胞、基底膜和星形胶质细胞足突组成[7]。其中内皮细胞及其之间的紧密连接形成物理屏障；星形胶质细胞分泌细胞外基质蛋白维持基底膜的功能，并完成血管和神经元之间的信号传递。正常情况下，血液中的大分子物质如纤维蛋白原、纤维蛋白等不能通过BBB进入脑实质，而在缺血条件下，氧化应激增加[8]、炎性细胞浸润[9]等参与破坏微血管完整性，导致通透性增高，血浆蛋白渗漏。本实验中观察到2-VO模型组有纤维蛋白原的血管外渗漏，并且在电镜下观察到BBB超微结构的改变，说明在CCH损伤过程中大脑皮质存在BBB的损伤。

周细胞为BBB的重要组成部分，其主要功能除了维持BBB稳定之外，还包括调节CBF及血氧代谢、调节血管稳定性、神经干细胞功能和吞噬细胞活性等[10-12]。本研究中观察到，2-VO 术后3 d周细胞数量开始增多，至14 d时周细胞数量最多，后期随着缺氧时间的延长，周细胞数量呈现下降趋势。然而血管数量并没有明显变化，因此周细胞增生并非由血管增多所引起。在慢性缺血早期，脑血流的减少还可能与周细胞的收缩有关[13]，因此在CCH早期周细胞的增多可能进一步加剧CBF减少，加速BBB损伤。有研究[14]显示，纤维蛋白原的渗出可刺激少突胶质细胞的变化，那么渗出的纤维蛋白是否对周细胞的增生有影响？因此本研究通过体外培养周细胞，检测不同浓度纤维蛋白原对周细胞的增生或毒性作用。结果表明低浓度纤维蛋白原对周细胞具有一定的促增生作用，而高浓度纤维蛋白原对周细胞具有毒性作用。因此CCH模型中早期观察到的周细胞数量增多可能与早期少量纤维蛋白原的渗漏有关，慢性期时周细胞数量的减少，可能与脑组织中纤维蛋白原累积增多，对周细胞产生毒性作用有关。有研究[15]表明，周细胞可以分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和9(MMP-2、MMP-9)，而MMP-2、MMP-9被蛋白水解酶激活后可作用于基底膜，破坏BBB[16-18]，因此周细胞的增生可能进一步加剧了BBB的损伤。当然这一假设需要后续实验的进一步验证。

总之，本研究发现，CCH可破坏BBB，早期伴有周细胞增生。BBB损伤导致的纤维蛋白原渗出可能是引起周细胞增生的主要原因，同时周细胞增生也可能进一步加重脑缺血及BBB损伤。