应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

曹 曦 宋丽妮 张怡尘 李 奇 杨金奎*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科，北京100730；2.糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京100730)

基因修饰动物模型是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具[1]。近年来新兴的一种来源于细菌的成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat， CRISPR)及临近相关基因(CRISPR-associated， Cas)系统经过改造后，因其操作简便、效率高而成为最热门的基因编辑技术，即 CRISPR/Cas9 技术。其与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease， ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease， TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前CRISPR/Cas9技术已经成功在细菌、水稻、小鼠、大鼠、斑马鱼、人等物种上得到运用[2-3]，由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。

CRISPR/Cas9技术的具体原理是：Cas9 是一种特殊的核酸内切酶，能与 sgRNA(single-guide RNA)结合，sgRNA 是人工合成的 tracrRNA(trans-activating RNA)/crRNA(crispr RNA)复合体。sgRNA 3′端 20个碱基通过碱基配对原则与目标 DNA 配对结合，其中sgRNA 所识别配对序列紧紧相邻的目标DNA 序列必须是NGG(N代表任一碱基，即前导间隔相邻基序列 (protospacer adjacentmotif， PAM)[4]，然后Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA，打断目标基因，再通过非同源重组(non-homologous end-joining， NHEJ)修复机制，随机插入或删除一定数量的碱基，产生错误修复甚至移码突变，而达到敲除靶基因的目的[5]。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system， RAS)在冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)、糖尿病心肌病及糖尿病肾病中起重要作用。ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴作为新发现的 RAS 调节轴，可拮抗经典轴ACE/Ang Ⅱ/AT1(Ang Ⅱtype 1 receptor)的生物效应。在2001～2002年间，两个研究小组同时发现了属于G蛋白偶联受体家族的新型受体，该受体被命名为Mrg[6]或与感觉神经元有关的特异性G蛋白偶联受体(sensory neurons specic receptor, SNSR)[7]。其中，MrgD是Mrg家族的一员，最初被发现在神经性疼痛的调节中起作用[8]。众所周知，Ang(1-7)已被确定为Mas受体的天然内源性配体[9]。然而，进一步研究[10]显示，Mrg家族与Mas受体有很高的同源性，并且用Ang(1-7)作用于过表达MrgD的细胞后促进了花生四烯酸的释放与转录激活。这些研究说明在Mrg受体家族和RAS之间可能存在着相互作用。所以，本研究运用CRISPR/Cas9 技术，设计了针对MrgD的sgRNA，成功诱导了MrgD的靶向突变，初步筛选后获得MrgD基因敲除的小鼠，为糖尿病发病机制研究提供了动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的小鼠均为 C57BL/6J 品系，体质量18～24 g，购自北京维通利华实验动物中心[实验动物许可证号：SCXK(京) 2016-0011]。小鼠饲养于北京大学医学部SPF级实验动物中心，恒温恒湿，12 h光照，12 h黑暗，自由采食。实验所使用的所有动物均经过首都医科大学附属北京同仁医院动物委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的选择

笔者从NCBI小鼠基因组网站得到MrgD基因(Gene ID: 211578)的序列和结构信息。遵从CRISPR/Cas9介导的基因组定点突变靶点设计原则，应用在线sgRNA靶序列设计软件(http://crispr. mit. edu/)，将小鼠MrgD基因(NM-203490.3)第一个外显子序列进行分析，得到评分较高的sgRNA序列(靶点序列：5′-CTCGCCATGGCCACGTGTGT-3′)。

1.2.2 显微操作与F0代鉴定

上述sgRNA及Cas9 mRNA进行小鼠受精卵胞质注射、回输、分娩等常规操作。3周龄F0代小鼠剪取尾尖0.5 cm置于1.5 mL的EP管内，加入500 μL裂解液和1 μL蛋白酶K贮存液，将上述EP管置于55 ℃恒温水浴锅水浴过夜，待消化完全，酚/氯仿法抽提基因组 DNA。以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增sgRNA靶向位点两侧各约200bp的序列。引物序列如下：MF， 5′-TGGCAGAGAGGTGGAGTGTA-3′; MR， 5′-ATGGGGAAAAGCACGGAGAG-3′。

PCR产物经纯化、变性、缓慢退火，进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。为进一步验证，将PCR产物进行TA克隆测序(测序由诺赛基因公司完成)。

1.2.3 繁育MrgD基因敲除的纯合小鼠

将含有MrgD基因大片段敲除的F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠进行繁育，得到F1代小鼠。剪取尾尖0.5 cm，经消化提取基因组DNA，用引物MF及MR进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离鉴定及测序，筛选F1代(杂合子)。然后，以筛选出的F1代(杂合子)小鼠作为亲本，交配繁育F2代，得到的F2代再进行基因鉴定，最终得到MrgD基因敲除纯合体小鼠，从而建立突变群体。

1.2.4 体质量监测

将小鼠分为4组(每组10只)：同周龄雄性C57BL/6J小鼠(A组)、同周龄雌性C57BL/6J小鼠(B组)、同周龄雄性MrgD敲除(MrgD-/-)小鼠(C组)及同周龄雌性MrgD-/-小鼠(D组)，以普通饲料进行喂养并监测体质量。

1.2.5 空腹血糖监测

将实验动物喂养至16周龄时尾静脉取血测小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)(0 min)，血糖测定用强生公司One-Touch血糖仪及配套试纸。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 成功构建MrgD大片段基因敲除小鼠

MrgD基因sgRNA及验证引物序列如图1所示。将sgRNA及Cas9 mRNA混合物通过显微注射注入小鼠受精卵胞质，然后回输移植到假孕的C57BL/6J母鼠中，共得到7只F0代小鼠，分别编码为1#～7#。对这7只小鼠进行基因组DNA提取与PCR扩增，并且通过琼脂糖凝胶电泳分离鉴定(图2)。结果表明，与野生型C57BL/6J小鼠基因型相比，6#小鼠发生了碱基的插入或缺失，而1、2、3、4、5及7#可能仍为野生型基因型。

为进一步确定基因型，将1#～7#小鼠基因PCR扩增产物做TA克隆测序。同时，对6#小鼠基因组DNA与野生型C57BL/6J小鼠基因进行比对，6#小鼠缺失173个碱基，其中123个碱基位于CDS区域，即敲除了MrgD蛋白的前41个氨基酸(图3)，长片段(500bp)比对结果表明不完全匹配，表明6#小鼠可能为嵌合体。因此，6#小鼠为成功构建的MrgD大片段基因敲除(嵌合体)的F0代小鼠。

图1 MrgD基因sgRNA及验证引物序列Fig.1 SgRNA and validation primer sequence for MrgD

图2 PCR扩增MrgD基因敲除序列附近PCR产物Fig.2 PCR amplification of MrgD， delete PCR product near the sequence

图3 F0代MrgD-/--6#小鼠与野生型小鼠MrgD靶序列比对Fig.3 Target sequences of MrgD in 6# F0 mouse mated with wild type mice

2.2 MrgD基因敲除小鼠与C57BL/6J野生型小鼠的体质量比较

MrgD基因敲除6#小鼠F0通过与C57BL/6J野生型雌性小鼠繁育得到阳性F1代，阳性F1代小鼠繁育得到F2代MrgD-/-纯合小鼠用于后续实验。

实验动物均饲养于SPF级实验动物中心，并且以普通饲料喂养。通过对4组实验动物体质量的长期监测，雄性和雌性C57BL/6J野生型小鼠以及MrgD-/-小鼠体质量随喂养时间均稳定增长。其中，雄性C57BL/6J野生型小鼠以及MrgD-/-小鼠体质量于16、17及18周两组体质量达到一致，18周以后雄性MrgD-/-小鼠体质量增长明显高于雄性C57BL/6J野生型小鼠，但差异无统计学意义(图4A)。此外，雌性MrgD-/-小鼠体质量均稍低于雌性C57BL/6J野生型小鼠，两组间差异无统计学意义(图4B)。

图4 各组小鼠间体质量的比较Fig.4 Comparison of weight among different mice groups

A：comparison of weight between group A and C；B：comparison of weight between group B and D；groupA: C57BL/6J male mice;groupB: C57BL/6J female mice;groupC:MrgD-/-male mice;groupD:MrgD-/-female mice.

2.3 各组小鼠空腹血糖比较

分别对普通饲养的18周龄雄性C57BL/6J小鼠(A组)与MrgD-/-小鼠(C组)，以及同周龄雌性C57BL/6J小鼠(B组)与MrgD-/-小鼠(D组)进行空腹血糖测定。结果显示，雄性MrgD-/-小鼠与C57BL/6J小鼠空腹血糖差异无统计学意义(图5A)，同样的，雌性MrgD-/-小鼠与C57BL/6J小鼠空腹血糖差异无统计学意义(图5B)。后续实验笔者计划通过高糖、高脂等特殊条件诱导，对MrgD-/-小鼠糖脂代谢进行深入研究。

3 讨论

胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病的主要发病机制。其中，胰岛素抵抗表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的摄取减少以及抑制肝糖输出的作用减弱[11]。目前，ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴作为新发现的 RAS 调节轴在糖尿病的发生发展中起重要作用。本课题组研究结果表明ACE2/Ang-(1-7)的上调可以改善小鼠胰岛细胞的氧化应激从而减少凋亡，增加胰岛素的分泌[12]，同时，也可以通过PI3K/Akt通路降低肝细胞糖异生相关酶的表达[13]，从而改善血糖水平。另一方面，研究[14]表明ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的激活可以降低骨骼肌、脂肪细胞中的活性氧簇(reactive oxygen species， ROS)，增加胰岛素刺激的葡萄糖摄取，从而改善糖代谢。然而，最近发现的MrgD作为Mrg家族的一员，其转录翻译后的蛋白与Mas受体一样作为Ang(1-7)多肽作用的另一个新发现的受体，并且存在着与Ang(1-7)类似的可作用于MrgD受体的多肽[15]。研究表明MrgD可能参与了肺癌等肿瘤的发生[16]、增加神经元兴奋性反应与调节疼痛感觉[17]等过程。但是，MrgD作为Ang(1-7)的受体所起的生理作用还不清楚。所以，构建MrgD敲除小鼠模型进行后续一系列研究就显得极为重要。

图5 各组小鼠空腹血糖的比较Fig.5 Comparison of fasting blood glucoseamong different mice group

A：comparison of FBG between group A and C；B：comparison of FBG between group B and D；groupA: C57BL/6J male mice;groupB: C57BL/6J female mice;groupC:MrgD-/-male mice;groupD:MrgD-/-female mice.n=10.FBG: fasting blood glucose;MrgD-/-:MrgDknockout mice.

CRISPR/Cas9技术因其操作简便、效率高而成为最热门的基因编辑技术，本研究通过应用在线sgRNA靶序列设计软件对小鼠MrgD基因(NM-203490.3)序列进行分析，得到评分较高的sgRNA，并通过扩增后与Cas9 mRNA混合一起通过显微注射注入小鼠受精卵胞质，再进行回输、代孕等操作，最终获得F0代。本实验成功获得F0代的6#小鼠(嵌合体)，通过繁育最终获得MrgD基因敲除纯合突变体小鼠。虽然，在普通条件饲养下本研究未显示MrgD基因敲除小鼠与野生型对照鼠的体质量和血糖差异，但是后期实验通过高糖、高脂等特色条件诱导MrgD基因敲除小鼠，相信能对MrgD基因进行更深入有效的研究。

本研究成功构建了MrgD基因敲除小鼠模型，并进行了初步试验，但还存在一些问题，比如只是在普通饲料喂养下进行了体质量与血糖的检测，后续应该再进行以高脂饲料喂养诱导后监测血糖，并更进一步进行糖脂代谢相关研究。从而为MrgD基因功能与糖尿病相关性的研究提供新的基础研究数据和结果。