4种胡椒科植物粗提物对灰葡萄孢的抑菌活性

祁之秋 李修伟 纪明山

（沈阳农业大学植物保护学院，辽宁沈阳 110161）

灰霉病是近年来保护地番茄、黄瓜、草莓等作物上的重要病害，发生时间早、持续时间长、传播速度快，一般减产20%～30%，严重时可减产50%以上（陈茂春，2018）。能否及时有效地防治灰霉病是番茄生产中的重要问题。化学防治是控制灰霉病的主要手段，但随之带来的抗药性、再猖獗、农药残留和环境污染等问题越来越引起人们的关注。从植物中寻找活性物质是开发新农药的重要方法，植物源农药也成为国内外研究的热点之一（张兴等，2015）。胡椒科植物荜茇、黑胡椒、白胡椒等是中蒙藏医常用药物（呼日乐巴根，2009）。本文测定了荜茇、假蒟、黑胡椒、白胡椒4种胡椒科植物粗提物对灰葡萄孢的抑菌活性，旨在为植物源抑菌农药新资源的寻找和发现提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病原菌：灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers），由沈阳农业大学农药科学实验室提供。

供试植物：荜茇（Piper longum L.）、假蒟（Piper sarmentosum Roxb.）、黑胡椒（black pepper）及白胡椒（white pepper），购于中药材市场。

化学药剂：98.2%嘧霉胺（pyrimethanil）原药购于昆山瑞泽农药股份有限公司，称取0.105 1 g原药，用丙酮定容到10 mL，配得10 000 mg·L-1母液，作为药剂对照。

1.2 试验方法

1.2.1 植物粗提物的提取 分别将4种供试植物粉碎，过60目筛；称取500 g（DW），用95%乙醇提取3次，加入的乙醇量分别为400、200、200 mL，每次提取48 h，合并萃取滤液；50 ℃减压浓缩得粗浸膏物，以乙醇为溶剂，配成1 g·mL-1活性物质提取物。

1.2.2 植物粗提物对灰葡萄孢菌丝生长的影响 采用菌丝生长速率法测定植物粗提物对灰葡萄孢的抑制作用。用乙醇将植物粗提物与PDA培养基混合，配制成浓度为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1的含药培养基，每个处理均以只加入乙醇的培养基为对照（CK0）。将嘧霉胺与PDA培养基混匀，制成最终浓度为128、32、8、2、1 μg·mL-1的含药平板，作为对照药剂（CK1）。每处理3次重复。将直径5 mm的灰葡萄孢菌饼接种于平板中央，25 ℃下培养4 d。测量菌落直径，求得每种植物提取物对灰葡萄孢的毒力回归方程、相关系数r和EC50。

1.2.3 植物粗提物对灰葡萄孢产孢量的影响 按照1.2.2的方法，配制植物粗提物及对照药剂的含药培养基，各处理浓度均设定为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，接种灰葡萄孢菌饼。将接种后的培养皿放入25 ℃恒温箱，培养至产孢（约25 d）。每平板距菌落边缘相等处挑取5个菌碟（φ=1 cm）放入空灭菌离心管中，加入2 mL无菌水，振荡冲洗1 min。在40倍显微镜下，利用血球计数板记录孢子数，每处理4次重复（Rod ír gueza et al.，2011）。

1.2.4 植物粗提物对灰葡萄孢孢子萌发的影响 取PDA平板上已产孢的灰葡萄孢菌，用无菌水配制孢子悬浮液（1×104个·mL-1），取20 μL滴在凹玻片上，再分别滴加20 μL不同稀释倍数的植物粗提液和对照药剂，使每处理浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1。混匀后置于25 ℃下培养12 h，以只加入乙醇的培养基为对照（CK0），每处理4次重复，在显微镜下观察并记录萌发孢子数，计算不同浓度植物粗提物对分生孢子萌发的抑制率。

1.2.5 植物粗提物对灰葡萄孢菌核产生的影响 按1.2.2的方法将灰葡萄孢接入含系列浓度粗提物的PDA平板中，25 ℃下培养25 d，观察在不同浓度的4种植物粗提物PDA平板上是否有菌核产生。

2 结果与分析

2.1 植物粗提物对灰葡萄孢菌丝生长的影响

胡椒科4种植物对灰葡萄孢菌丝生长均有较强的抑制作用。当各处理浓度为0.5 g·mL-1时，荜茇提取物对灰葡萄孢菌丝生长的抑制率最高，达到91.8%，其次是白胡椒和黑胡椒提取物，分别达到86.4%和50.8%，假蒟提取物的抑制率仅为36.8%。从表1中可以看出，荜茇、假蒟、黑胡椒和白胡椒对灰葡萄孢的EC50分别为0.032 2、0.883 2、0.398 0、0.007 9 g·mL-1。但 4种胡椒科植物粗提物对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用明显低于嘧霉胺。

表1 植物粗提物对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用

2.2 植物粗提物对灰葡萄孢产孢量的影响

相同浓度下，荜茇、假蒟粗提物对灰葡萄孢产孢量的抑制作用较强，其次为白胡椒，黑胡椒抑制作用较低（表2）。当浓度为0.5 g·mL-1时，荜茇、假蒟和白胡椒粗提物对灰葡萄孢产孢量的抑制率分别为92.8%、92.0%和82.8%，而黑胡椒粗提物的抑制率仅达58.8%；当浓度为0.062 5 g·mL-1时，荜茇和假蒟对灰葡萄孢产孢量的抑制作用仍达60%以上。但植物粗提物对灰葡萄孢产孢量的抑制作用远小于化学药剂嘧霉胺。

表2 植物粗提物对灰葡萄孢产孢量的影响

2.3 植物粗提物对灰葡萄孢孢子萌发的影响

4种植物粗提物对灰葡萄孢孢子萌发有强烈的抑制作用（表3）。相同浓度下，黑胡椒和白胡椒粗提物对灰葡萄孢孢子萌发的抑制作用强于荜茇和假蒟，当浓度为0.031 25 g·mL-1时，二者对灰葡萄孢孢子萌发的抑制率仍高于65%，而荜茇和假蒟粗提物对孢子萌发的抑制率不到30%。对照药剂嘧霉胺对灰葡萄孢孢子萌发的抑制作用最强，抑制率在98%以上。

表3 植物粗提物对灰葡萄孢孢子萌发的影响

2.4 植物粗提物对灰葡萄孢菌核产生的影响

从表4可以看出，除了0.031 25 g·mL-1假蒟粗提物对灰葡萄孢菌核无影响外；4种植物粗提物浓度高于0.062 5 g·mL-1时，均能完全抑制灰葡萄孢菌核的产生。

表4 植物粗提物对灰葡萄孢菌核产生的影响

3 结论与讨论

植物源活性物质的研究已成为当前的热点与趋势，并取得了显著的成果（张兴 等，2015）。胡椒科植物多数具有药用价值，其中的活性物质研究也受到了广泛的关注（孙丹 等，2008；Gulzar et al.，2013）。本试验结果表明，胡椒科植物荜茇、假蒟、黑胡椒和白胡椒的乙醇粗提物对灰葡萄孢发育的各阶段都有较强的抑制作用。白胡椒乙醇提取物对菌丝生长的抑制作用最强，EC50为0.007 9 g·mL-1，其次为荜茇、黑胡椒和假蒟。孙丹等（2008）的研究表明，假蒟和草胡椒的粗提物对8种植物病原菌菌丝生长具有抑菌活性，与本试验结果一致。尽管采用乙醇萃取植物中次生代谢产物已有许多报道（鲁世伟 等，2010；闫红豆 等，2014；陈楚英等，2016），但因溶剂单一，可能会导致植物中某些活性成分漏筛。为提高活性物质产量和防止活性物质漏筛，可进一步选用不同极性的有机溶剂萃取活性物质。本试验中胡椒科4种植物提取物对灰葡萄孢生长发育各阶段的抑制作用均小于化学药剂嘧霉胺，这是因为本试验中的植物提取物为粗提物，其中杀菌活性成分含量较低，而这些有效成分具有强烈的抗菌活性。分离这些活性物质并鉴定其分子结构，有可能发现具有新型杀菌活性、新型作用机制的先导化合物，为胡椒科植物源农药的开发奠定基础。