生育酚及其衍生物保护自由基诱导的生物大分子损伤和抑制HepG2细胞增殖的作用

韩静静，田丹丹，高玉星，肖春霞

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

VE又名生育酚，是生物体内的天然抗氧化剂，广泛分布于谷物、种子、果蔬和动物产品中，具有清除自由基[1]、维持哺乳动物及禽类生育[2-3]、调节免疫[4]、抑制血小板凝集和黏附[5]等功能。但VE不溶于水，遇碱不稳定，对氧气、光照敏感，易被氧化，并且某些金属离子如Fe2＋可加速其氧化[6]。此外，Reboul等[7]发现VE的生物利用率不稳定，容易受到食物基质、食品加工过程等的影响，因此限制了其在食品、药品和化妆品等领域中的应用。随着研究的深入，一系列生育酚衍生物如生育酚醋酸酯（tocopheryl acetate，TA）、生育酚烟酸酯（tocopheryl nicotinate，TN）、生育酚琥珀酸酯（α-tocopheryl succinate，α-TOS）等被陆续报道。这些衍生物均是VE的游离羟基与醋酸、烟酸、琥珀酸的羧基酯化形成的酯类衍生物，由于VE的活泼羟基被保护，这些衍生物具有更好的稳定性，而亲水性羧基基团则增加了其水溶性。此外，这些衍生物还表现出良好的生物活性，这可能是由于新引入的酸酐结构导致了VE功能的变化[8]。Badraoui等[9]通过体内、体外实验证明，TA能抑制氧化应激损伤，并能诱导乳腺癌细胞凋亡。Schlieper等[10]发现TN具有改善心律不齐的功效。Prasad等[11]研究发现，与TA、TN相比，α-TOS对黑色素瘤细胞生长分化的抑制作用更明显。此外，α-TOS对结肠癌[12]、乳腺癌[13]、胃癌[14]等多种恶性肿瘤细胞的增殖有良好的抑制作用。Rego等[15]比较了TN和α-TOS对视网膜细胞氧化的抑制作用，结果表明后者作用更为明显。大量文献表明，在众多生育酚衍生物中α-TOS的生物活性较为突出[11-15]。近年来，一种新的生育酚衍生物——生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）的绿色合成研究备受关注[16]，TPGS是α-TOS的游离羧基与大量聚乙二醇酯化而成，亲水性聚乙二醇极大地改善了TPGS的水溶性，由于其两亲性质，可作为增溶剂、乳化剂、稳定剂等使用[17-18]。Thi等[19]以TPGS为载体制备了不溶性药物的传递体系，可延长药物在血液及组织中的循环时间。Nguyen等[20]报道TPGS包裹紫杉醇可增加其体外摄取率，使其更容易进入固态瘤中心。Zhu Xianbing等[21]发现槲皮素经TPGS包裹，增加了其水溶性及抗紫外线损伤能力，并提高了其在皮肤表皮层和真皮层的存留量。TPGS已被美国食品药品监督管理局批准为安全的药用辅料[22]，但关于TPGS的生物活性鲜有报道。

本研究对比了VE、α-TOS、TPGS对自由基诱导的生物大分子氧化损伤的保护作用，以及对人肝癌细胞（HepG2细胞）增殖的抑制作用，旨在比较研究VE不同衍生物之间生物活性的差异，探讨其内在机理，为VE及其衍生物在食品中的广泛应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

VE、α-TOS、TPGS（结构式见图1） 成都艾科化学技术有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海泽龙生物工程有限公司；2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2’-azobis-2-methylpropanimidamide,dihydrochloride，AAPH）、鲱鱼精DNA（herring sperm DNA，hsDNA）、亚油酸（linoleic acid，LA）、偶氮二异庚腈（2,2’-azobis(2,4-dimethyl)valeronitrile，AMVN）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美国Sigma公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Amresco公司；三氯乙酸 天津市博迪化工有限公司；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA） 国药集团药业股份有限公司；考马斯亮蓝 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；五水硫酸铜、30%过氧化氢、七水合硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、甲醇、冰乙酸均为分析纯。

图1 VE（A）、α-TOS（B）和TPGS（C）的结构式Fig. 1 Structures of VE (A), α-TOS (B) and TPGS (C)

HepG2细胞购自上海生命科学研究院，用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.2 仪器与设备

电泳仪（电泳供电装置）、凝胶成像系统 美国伯乐公司；UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；BP211D型精密电子天平 德国Startorius公司；HH-2型恒温水浴锅 江苏省金坛市环宇科学仪器厂；Max M2型多功能微孔板检测仪 美国Molecular公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu2＋/H2O2诱导BSA氧化、羰基化的测定

在BSA终质量浓度为0.8 mg/mL的反应体系中，先加入不同浓度的VE、α-TOS和TPGS使其终浓度分别为10、50、100、500、1 000 µmol/L（均用甲醇溶解），空白组以等体积的磷酸盐缓冲液代替，模型组以等体积的甲醇代替，漩涡振荡混匀，置于37 ℃水浴中预处理10 min。然后加入Cu2＋/H2O2反应体系（空白组不加），并将所有反应组用磷酸盐缓冲液定容至500 μL，使Cu2＋和H2O2的终浓度分别为100 µmol/L和2.5 mmol/L，37 ℃水浴反应60 min。反应结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色法检测BSA氧化损伤程度，采用DNPH比色法检测BSA羰基化程度[23]。

1.3.2 AAPH诱导BSA氧化、羰基化的测定

蛋白模型和VE、α-TOS、TPGS处理方法同1.3.1节，预处理结束后加入AAPH（空白组不加），使其终浓度为50 mmol/L，置于37 ℃水浴反应5 h。反应结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色法检测BSA氧化损伤程度，采用DNPH比色法检测BSA羰基化程度[23]。

1.3.3 自由基诱导LA过氧化的测定

采用Fe2＋/VC反应体系产生的羟自由基（·OH）[24]、AMVN热分解产生的烷氧自由基（ROO·）[25]诱导LA发生脂质过氧化反应。

在LA（甲醇助溶）终浓度为1 mmol/L的反应体系中，先分别加入不同浓度的VE、α-TOS和TPGS使其终浓度分别为10、50、100、500、1 000 µmol/L（均用甲醇溶解），空白组以等体积的磷酸盐缓冲液代替，模型组以等体积的甲醇代替，混匀后加入Fe2＋/VC或AMVN（空白组不加），将所有反应组用磷酸盐缓冲液定容至1 mL，使反应体系中Fe2＋、VC、AMVN的终浓度分别为50 µmol/L和1、10 mmol/L。Fe2＋/VC体系37 ℃水浴避光反应24 h，AMVN体系反应12 h。反应结束后，以硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）浓度表示LA脂质过氧化水平[26]。

1.3.4 AAPH诱导DNA氧化损伤的测定

在hsDNA终质量浓度为2 mg/mL的反应体系中，先加入不同浓度的VE、α-TOS和TPGS使其终浓度分别为10、50、100、500、1 000 µmol/L（均用甲醇溶解），空白组以等体积的磷酸盐缓冲液代替，模型组以等体积的甲醇代替，再加入AAPH溶液（空白组不加），并用磷酸盐缓冲液将所有反应组定容至1 mL，使AAPH的终浓度为40 mmol/L，混匀后37 ℃水浴反应12 h。反应结束后采用TBA法检测DNA氧化损伤程度[27]。

1.3.5 MTT法测定细胞活力

将HepG2细胞接种于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜，使细胞贴壁。分别加入不同浓度（10、20、30、40、50 µmol/L）的VE、α-TOS和TPGS，空白组不加。每组设置8 个平行，置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h。弃上清液，每孔加入100 μL终质量浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，置于培养箱中继续培养，4 h后弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。使用多功能微孔板检测仪测定各孔在570 nm波长处的OD值，并根据下式计算细胞存活率。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 VE、α-TOS和TPGS对自由基诱导蛋白质损伤的影响

2.1.1 VE、α-TOS和TPGS对Cu2＋/H2O2诱导BSA氧化降解的影响

图2 VE、α-TOS和TPGS对Cu2＋/H2O2诱导BSA氧化降解的影响Fig. 2 Effects of VE, α-TOS and TPGS on Cu2+/H2O2-induced BSA oxidative degradation

Fe2＋、Fe3＋、Cu2＋、Mn2＋、Ni2＋等金属离子可以催化H2O2分解，产生氧化活性更高的·OH，·OH能与所有氨基酸反应[28]，因此本实验采用Cu2＋/H2O2反应体系诱导BSA氧化损伤，探讨VE、α-TOS和TPGS对自由基诱导BSA氧化降解的抑制作用。从图2A可以看出，VE对Cu2＋/H2O2诱导的BSA氧化降解没有明显规律性。而α-TOS、TPGS均浓度依赖性地抑制了BSA的氧化降解，在500、1 000 μmol/L浓度下，α-TOS和TPGS的抑制作用显著。由图2D可知，相同浓度下（500 μmol/L），与VE、α-TOS相比，TPGS对Cu2＋/H2O2诱导的BSA氧化降解的抑制作用最明显，与模型组相比差异极显著（P＜0.01）。

2.1.2 VE、α-TOS和TPGS对AAPH诱导BSA氧化降解的影响

AAPH是一种水溶性的偶氮类化合物，通过均裂产生ROO·，在37 ℃和中性pH值条件下能稳定地产生自由基[29]。如图3所示，VE、α-TOS和TPGS均能显著抑制AAPH诱导的BSA氧化降解，在10～500 μmol/L浓度范围内呈浓度依赖性，并且在500 μmol/L时最强，在1 000 μmol/L时有所减弱，但与模型组相比仍有极显著差异（P＜0.01）。图3D表明，相同浓度（500 μmol/L）处理时，TPGS的抑制作用最明显，且与空白组相比没有显著差异，即500 μmol/L的TPGS很好地抑制了AAPH诱导的BSA氧化降解。

2.1.3 VE、α-TOS和TPGS对Cu2＋/H2O2诱导BSA羰基化的影响

如图4所示，BSA本身羰基化程度很低，在Cu2＋/H2O2作用下发生明显的羰基化修饰。加入VE、α-TOS和TPGS后，BSA羰基化程度明显受到抑制，且抑制作用随浓度的升高而增强。由图4D可知，相同浓度（500 μmol/L）的VE、α-TOS和TPGS均能显著抑制BSA羰基的产生，但TPGS抑制作用最明显。

图3 VE、α-TOS和TPGS对AAPH诱导BSA氧化降解的影响Fig. 3 Effects of VE, α-TOS and TPGS on AAPH -induced BSA oxidative degradation

图4 VE、α-TOS和TPGS对Cu2＋/H2O2诱导BSA羰基化的影响Fig. 4 Effect of VE, α-TOS and TPGS on Cu2+/H2O2-induced carbonylation of BSA

2.1.4 VE、α-TOS和TPGS对AAPH诱导BSA羰基化的影响

图5 VE、α-TOS和TPGS对AAPH诱导BSA羰基化的影响Fig. 5 Effects of VE, α-TOS and TPGS on AAPH-induced carbonylation of BSA

由图5可知，AAPH诱导BSA发生明显的羰基化修饰。VE、α-TOS和TPGS均浓度依赖性地抑制BSA羰基化修饰。如图5D所示，500 μmol/L的VE、α-TOS和TPGS均显著抑制了BSA羰基的产生，其中TPGS对AAPH诱导的BSA羰基化损伤的抑制作用最明显。

2.2 VE、α-TOS和TPGS对自由基诱导LA过氧化的影响

2.2.1 VE、α-TOS和TPGS对Fe2＋/VC诱导LA过氧化的影响

图6 VE、α-TOS和TPGS对Fe2＋/VC诱导LA过氧化的影响Fig. 6 Effects of VE, α-TOS and TPGS on LA peroxidation induced by Fe2+/VC

图7 VE、α-TOS和TPGS对AMVN诱导LA过氧化的影响Fig. 7 Effects of VE, α-TOS and TPGS on LA peroxidation induced by AMVN

LA在脂质过氧化过程中会形成亚油酸氢过氧化物、4-羟基壬烯醛、丙二醛等氧化产物，这些产物能与TBA发生反应生成TBARS，其含量是衡量脂质过氧化程度的重要指标之一[30]。由图6可知，LA在自然条件下自氧化反应很慢，生成TBARS浓度较低，Fe2＋/VC反应体系诱导LA发生过氧化反应，VE、α-TOS和TPGS均显著抑制了LA过氧化，且其抑制作用随浓度的升高而增强。图6D表明，相同浓度（500 μmol/L）下，TPGS对LA过氧化的抑制作用最强。

2.2.2 VE、α-TOS和TPGS对AMVN诱导LA过氧化的影响

AMVN是一种脂溶性偶氮类化合物，通过热分解产生ROO·，常作为自由基引发剂用于脂质过氧化反应模型的建立[31]。如图7所示，LA自然条件下生成的TBARS浓度很低，AMVN诱导LA发生过氧化反应，TBARS浓度极显著增加（P＜0.01）。图7A～C表明，VE、α-TOS和TPGS均浓度依赖性地抑制了LA过氧化。图7D表明，相同浓度（500 μmol/L）的VE、α-TOS和TPGS中，TPGS对AMVN诱导的LA过氧化的抑制作用最强。

2.3 VE、α-TOS和TPGS对AAPH诱导DNA氧化损伤的影响

图8 VE、α-TOS和TPGS对AAPH诱导DNA氧化损伤的影响Fig. 8 Effects of VE, α-TOS and TPGS on AAPH-initiated DNA oxidation

AAPH热分解生成的ROO·使DNA分子的双螺旋结构解旋，并最终生成含有羰基的20余种小分子化合物，DNA形成的裂解产物在酸性条件下与TBA反应生成TBARS[27]，本实验通过检测TBARS含量来研究不同浓度的VE、α-TOS和TPGS对ROO·诱导DNA氧化损伤的抑制作用。由图8可知，hsDNA在AAPH诱导下发生氧化损伤。随着加入VE、α-TOS和TPGS浓度的增加，其对DNA氧化损伤的抑制作用增强。从图8D可以看出，相同浓度（500 μmol/L）下，TPGS对AAPH诱导的DNA氧化损伤的抑制作用最强。

2.4 VE、α-TOS和TPGS对HepG2细胞活力的影响

图9 VE、α-TOS和TPGS对HepG2细胞活力的影响Fig. 9 Effects of VE, α-TOS and TPGS on HepG2 cell viability

活细胞能将外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，经DMSO溶解并测定其OD值可间接反映活细胞数量。MTT法是测定细胞活力最常见、直接的方法[32]。如图9所示，以空白组细胞存活率为100%，VE对HepG2细胞存活率没有明显影响；而随着α-TOS、TPGS浓度的增加，HepG2细胞存活率逐渐下降，与空白组相比差异极显著（P＜0.01），其中TPGS对HepG2细胞增殖抑制作用最强。

3 讨 论

VE常作为油脂加工中的抗氧化剂应用在肉类腌制中防止亚硝胺的生成，此外还具有多种生理功能。Azzi等[33]报道VE能改善与氧化应激相关的心血管疾病、癌症、神经退行性疾病、白内障等疾病。Bošković等[34]发现补充一定量的VE可改善精神分裂症患者的运动阻滞状况。但VE在氧气存在条件下不稳定，α-TOS和TPGS通过酯化修饰提高了化学稳定性，其中α-TOS能显著抑制巨噬细胞NO的生成[35]，并降低环孢菌素A对大鼠肝细胞的毒性[36]。TPGS由于具有良好的水溶性，被广泛应用于难溶药物的传递体系中，以提高药物的渗透性和吸收效率[18,37-38]，但尚鲜有针对VE和其水溶性衍生物α-TOS、TPGS生物活性差异的报道。

自由基具有未配对电子，化学性质非常活泼。在正常条件下，自由基参与细胞内的信号转导、免疫防御、增殖、凋亡等多种生理活动[39]。当体内氧化和抗氧化体系平衡被打破时，过量的自由基就会攻击体内的蛋白质、脂质、DNA等生物大分子，最终造成机体损伤。活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是自由基的一种，在应激状态下可攻击蛋白质、脂质、DNA等，进而诱发多种疾病，例如肿瘤[40]、神经退行性疾病[41]等。研究表明，ROS不仅参与肿瘤的产生，还与肿瘤的转移密切相关[42]。

本实验以Cu2＋/H2O2、AAPH、AMVN等体系诱导产生自由基，对比研究VE、α-TOS、TPGS对自由基引起的生物大分子体外损伤的保护作用，结果表明，与VE、α-TOS相比，TPGS对生物大分子（蛋白质、脂质、DNA）损伤的保护作用最强。许多学者曾认为α-TOS发挥抗肿瘤功效是由于α-TOS水解释放的VE发挥的作用，但多项研究表明，α-TOS是以整体的分子形式发挥作用，并不依赖于VE[43-44]。本研究结果显示，TPGS对自由基诱导的生物大分子损伤的保护作用优于VE，推测TPGS可能也是以整体分子形式发挥抗氧化作用的，而不依赖于其水解产生的VE。TPGS结构中的琥珀酸酯保护了化学性质活泼的酚羟基，提高其稳定性，而高度聚合的聚乙二醇结构保护琥珀酸的另一个游离羧基，随着聚乙二醇链段长度的增加，亲水性也随之增加。TPGS由于具有两亲性，在磷酸盐缓冲液中，其疏水端与生物大分子（蛋白质、脂质、DNA）相互作用，吸附在生物大分子表面，而聚乙二醇与水具有较强的亲和力，在磷酸盐缓冲液中充分伸展，为自由基攻击生物大分子提供了较大的空间位阻，从而达到对生物大分子的最佳保护效果。在HepG2细胞模型中，VE对HepG2细胞的存活率没有明显影响，而α-TOS和TPGS均能够显著降低HepG2细胞存活率，其中TPGS的抑制作用更为明显。这可能是由于TPGS亲水性强，与生物膜磷脂成分的相互作用弱，透过生物膜时的阻力减小、效率增加，在HepG2细胞内有效浓度大大增加。P-糖蛋白是一种由基因编码的跨膜蛋白，在小肠、肝、肾等组织中分布广泛，能够外排大量结构和功能各异的外源性分子，Dintaman等[45]的研究表明TPGS是一种P-糖蛋白的抑制剂，可以抑制P-糖蛋白的外排作用，由此推测TPGS可能通过抑制HepG2细胞膜P-糖蛋白的外排作用，增加其在细胞内的浓度，从而更有效地抑制HepG2细胞增殖。

4 结 论

本实验采用多种自由基体系对比研究VE及其衍生物α-TOS、TPGS对自由基引起的生物大分子体外损伤的保护作用，并从抑制HepG2细胞增殖方面比较其生物活性的差异，发现TPGS的抑制作用最显著。这可能是由于TPGS引入了亲水性强的聚乙二醇结构，在磷酸盐缓冲液中充分伸展，为自由基攻击生物大分子提供了较大的空间位阻；并且TPGS亲水性强，更容易透过生物膜，减少生物膜的外排作用，提高在细胞中的有效浓度。作为一种安全的食品药品传递载体，相较于VE和传统的VE衍生物，TPGS具有更好的水溶性和稳定性。本研究结果将对VE及其衍生物的广泛应用提供一定的理论依据。