大豆自然老化时间对豆浆理化特性及风味品质的影响

吴永庆，张华江，迟厚裕，夏 宁，徐丽娜，刘媛媛，李 彤

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

大豆自然老化是指成熟后的大豆籽粒在室温环境下放置的过程中，其蛋白质、脂肪、糖类及其他营养成分含量降低且活力下降，甚至出现活力完全丧失或死亡的变化过程，同时也是一种随着大豆贮藏时间的延长而发生的自然不可逆的过程[1]。大豆从收获到制成豆制品要经过一系列运输、贮藏和加工的过程，而在这一系列过程中会造成大豆不同程度的老化。我国的主要大豆种植区在东北地区，而大豆加工企业多分布在东南沿海省份，大豆相关产品的消费也主要集中在东南沿海地区[2]，大豆在由东北地区运输到东南沿海地区的过程中，贮藏环境和时间的不同对大豆的物理化学性质有着不同程度的影响。豆浆是我国传统的绿色营养早餐饮品，富含多种人体所需的营养成分，属于一种营养丰富且具有一定保健作用的蛋白饮料。豆浆不仅富含优质蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等多种营养成分，而且含有异黄酮、大豆皂苷、大豆低聚糖和卵磷脂等具有保健功能的特殊保健因子，因此深受广大人民的喜爱[3-5]。我国喜欢喝豆浆的人数众多，对豆浆的需求量也较大，因此人们对豆浆的营养价值越来越重视。我国豆浆市场的前景非常广阔，因而对豆浆的研究具有重要的现实意义。

如今豆浆加工厂的制浆工艺逐渐趋于成熟，但是市场上豆浆的品质却参差不齐，即使是同一厂家的豆浆，各批次的品质也有很大差异，其原因可能与大豆的贮藏时间有关，老化会使大豆种子的脂肪酸、粗蛋白和可溶性糖含量出现不同程度的下降[6]。田茜[7]的研究发现，大豆老化破坏了大豆胚轴线粒体的完整性。吴聚兰等[8]对晋豆19号进行40 ℃、相对湿度100%老化处理，发现人工老化的大豆发芽指标与粗脂肪含量成正相关，与粗蛋白含量成负相关。高华伟等[9]的研究发现自然老化的大豆发芽率高于人工老化。Kamizake等[10]的研究发现：自然老化和人工加速老化后，大豆籽粒的栅栏细胞变皱，籽粒颜色加深，蒸煮后硬度增加，蛋白质、脂肪含量下降；大豆老化后植酸含量无变化，酚类化合物和酸度增加。Kamizake等[11]还发现随着老化时间的延长，豆腐的产量降低。Hou等[12]的研究发现，大豆在30 ℃、相对湿度84%条件下贮藏9 个月后，可溶性总糖含量下降40%。Locher等[13]的研究发现，大豆在30 ℃、相对湿度82%条件下贮藏后低聚糖含量显著下降。Thomas等[14]将大豆在20 ℃、相对湿度65%条件下贮藏8 个月后发现，豆浆的蛋白质提取率下降了14%。大豆从收获到加工成豆制品往往需要经过一系列的运输与贮藏，这期间发生的老化影响着豆制品的品质，因此自然老化对豆浆品质的影响是豆制品行业中亟待研究的课题。目前的报道多是关于老化对大豆品质的影响，而忽略了其对豆浆品质的影响。迄今关于自然老化对豆浆综合品质，包括营养物质含量、稳定性、沉淀性及风味物质的影响尚鲜见报道。因此，本研究系统全面地研究了大豆不同自然老化时间对豆浆理化特性及风味品质的影响，对进一步改善豆浆综合品质有理论和实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东农42（收获1 个月）由东北农业大学大豆研究所提供。2-甲基-3-庚酮（纯度在99%以上） 美国Sigma Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

B-324全自动凯氏定氮仪 瑞士步琪实验仪器公司；Zetasizer Nano ZS 90型纳米粒径电位分析仪 英国马尔文公司；顶空-固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）搅拌加热装置、PDMS/CAR/DVB萃取头 美国Supelco公司；6890/5975B气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆自然老化

大豆自然老化实验设计参考Kamizake等[10]的方法，并进行一定的修改。大豆置于自然老化环境（17～25 ℃，相对湿度49%～80%）下，老化时间为12 个月，期间每隔2 个月取一定量样品制浆，用于豆浆品质（蛋白质、脂肪、可溶性固形物含量、风味物质的种类和含量）的分析。以在20 ℃、相对湿度47%的恒温恒湿环境下平衡10 h的大豆为对照组并制备豆浆进行相应分析。

1.3.2 豆浆的制备

准确称取一定质量的大豆，自来水洗涤3 次除去沙粒等杂物，蒸馏水洗2 次，按料液比1∶3在室温下浸泡12 h，除去多余水分，以料液比1∶7用豆浆机磨浆，冷却，80 目滤网过滤取浆，95 ℃保持5 min得豆浆。为减少样品造成的实验差异，同一批实验处理所用豆浆为同次制备。

1.3.3 豆浆蛋白质、脂肪及可溶性固形物含量测定

蛋白质含量参照GB 5009.5—2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[15]中凯氏定氮法进行测定，蛋白质分析系数为6.25。脂肪含量严格按照GB 5413.3—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》[16]方法测定，测定3 次求平均值。可溶性固形物含量采用手持折光仪测定，测定3 次取平均值。

1.3.4 蛋白质提取率的测定

大豆和豆浆的蛋白质含量测定方法见1.3.3节，蛋白质提取率按公式（1）计算。

1.3.5 豆浆稳定性的测定

取适量豆浆样液，用蒸馏水稀释50 倍，取一部分稀释后样液于4 000 r/min离心5 min，在785 nm波长处用分光光度计分别测定豆浆离心前后的吸光度，豆浆的稳定系数按公式（2）[17]计算，以此表征豆浆稳定性。

式中：R为稳定系数，R≤1.00，R值越大表明豆浆体系越稳定；A后为离心后上清液吸光度；A前为离心前样品吸光度。

1.3.6 豆浆沉淀性的测定

1.4 观察30 d死亡事件 对入选患者进行门诊和电话随访，观察患者30 d内死亡事件的发生情况。1.5 统计学处理 应用SPSS 25.0软件进行统计分析。对计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本 t检验，若方差不齐采用校正 t检验。用MedCalc软件计算受试者工作特征（ROC）曲线，用曲线下面积（AUC）表示各评分的预测价值，AUC比较采用Z检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

在己知质量（m1/g）的离心管中加入已知质量（m0/g）的样品，4 000 r/min离心15 min，弃去上层液体，倒扣试管沥干10 min后称质量（m2/g），按式（3）计算沉淀率，以此表征沉淀性。

1.3.7 豆浆粒径的测定

采用Zetasizer Nano ZS 90型纳米粒径电位分析仪对不同样品进行测定，每种样品平行测定3 次，得到粒径分布曲线。

1.3.8 豆浆风味物质的测定

HS-SPME条件[18]：取5 mL样品置于10 mL萃取瓶中，放入转子，再加入1 μL的内标物（2-甲基-3-庚酮），将老化的固相微萃取针插入样品瓶，40 ℃水浴锅平衡30 min后，边搅拌边顶空吸附，萃取温度40 ℃，萃取时间30 min，搅拌速率600 r/min。

GC条件：采用DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升温程序：起始温度40 ℃，保持4 min；然后以6 ℃/min升温至100 ℃；再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持7 min；不分流进样。MS条件：电子轰击离子源，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，电子能量70 eV，扫描范围m/z 40～400。

在利用NIST 2011质谱检索库检索的基础上，选择匹配度大于80%的鉴定结果，同时运用峰面积归一化法加2-甲基-3-庚酮作为内标定量，确定豆浆风味物质的种类和质量浓度。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 大豆自然老化时间对豆浆可溶性固形物和脂肪含量的影响

图1 大豆自然老化时间对豆浆可溶性固形物（A）和脂肪含量（B）的影响Fig. 1 Effect of soybean natural aging time on the contents of soluble solid (A) and fat (B) in soybean milk

由图1A可知，随着大豆自然老化时间的延长，豆浆中可溶性固形物含量呈现逐渐下降的趋势。而自然老化超过8 个月后，可溶性固形物含量曲线趋于平稳，无明显下降趋势，说明豆浆可溶性固形物含量基本稳定。对照组豆浆中可溶性固形物含量最高，为6.50 g/100 g，自然老化4、6、8、10 个月后，可溶性固形物含量分别为6.47、6.43、6.33、6.32 g/100 g，下降幅度分别为0.46%、1.07%、2.60%、2.77%；可明显看出，自然老化8 个月与6 个月相比可溶性固形物含量下降幅度较大，为1.53%。这是由于自然老化会导致大豆硬度增加[6]，浸泡膨胀度降低，而在大豆磨浆时由于其膨胀度不够，使留在豆渣中的可溶性固形物增多，导致豆浆中的可溶性固形物含量下降[19]。

脂肪含量的变化趋势与可溶性固形物相似，均随着大豆自然老化时间的延长而下降。由图1B可知，对照组的脂肪含量为0.58 g/100 g，自然老化4、6、8、10 个月后，脂肪含量分别为0.57、0.55、0.51、0.50 g/100 g，下降幅度分别为1.72%、5.17%、12.09%、12.28%，可明显看出自然老化6～8 个月期间脂肪含量下降幅度最大，为6.92%。这是由于大豆自然老化期间，环境对大豆表皮持续作用，使部分膜磷脂损坏从而引起脂质的水解和氧化反应，导致脂肪含量降低[20]。同时，大豆在贮藏期间部分蛋白质变性使大豆的网络结构改变，这种网络结构不益于细胞器的流动，导致制浆时脂肪的提取率降低[21]。

2.2 大豆自然老化时间对豆浆蛋白质含量及其提取率的影响

图2 大豆自然老化时间对豆浆蛋白质含量（A）及其提取率（B）的影响Fig. 2 Effect of soybean natural aging time on the content (A) and extraction rate of protein (B) in soybean milk

由图2A可知，随着大豆自然老化时间的延长，蛋白质含量呈现逐渐下降趋势，而自然老化时间超过8 个月后，蛋白质含量曲线趋于平稳，无明显下降趋势，表明蛋白质含量基本稳定。对照组的蛋白质含量为3.61 g/100 g，自然老化4、6、8、10 个月后，蛋白质含量分别为3.57、3.50、3.32、3.28 g/100 g，下降幅度分别为1.10%、3.05%、4.75%、5.41%，可以看出自然老化6～8 个月期间蛋白质下降幅度最大，为1.70%，这与可溶性固形物和脂肪含量的变化情况相仿。随着自然老化时间的不断延长，蛋白质、脂肪和可溶性固形物含量均有不同程度的减少，这与Kong Fanbin[19]、Kamizake[21]和Thomas[14]等的研究结果一致。这是由于大豆在自然老化期间，温度和相对湿度长时间持续作用于大豆籽粒，破坏了细胞内区室，继而引起一系列化学反应，包括蛋白质的变性聚集，造成了豆浆中蛋白质含量的降低[21]。

豆浆的蛋白质提取率是反映大豆籽粒蛋白质利用程度的重要指标，而在自然老化时间超过8 个月后，蛋白质提取率曲线逐渐趋于平稳，无明显的下降趋势，说明豆浆的蛋白质提取率基本稳定。由图2B可知，随着大豆自然老化时间的延长，蛋白质提取率呈现逐渐下降的趋势。对照组的蛋白质提取率为81.69%，自然老化4、6、8、10 个月后，蛋白质提取率分别为81.30%、81.05%、80.42%、80.33%，下降幅度分别为0.48%、0.78%、1.55%、1.66%。Hou等[22]的研究发现，大豆在贮藏期间β-折叠结构含量减少，α-螺旋结构含量增加，但是蛋白质的分子质量没有变化，这表明贮藏期间蛋白质变的更加聚集，从而使磨浆时蛋白质的溶出率下降，这可能是引起豆浆蛋白质提取率降低的原因之一。由图1、2可知，大豆自然老化6～8 个月期间可溶性固形物、脂肪和蛋白质含量及蛋白质提取率下降幅度最大，因此，大豆贮藏时间为6 个月以内时，其主要营养成分含量可以维持在较高水平。

2.3 大豆自然老化时间对豆浆稳定性和沉淀性的影响

图3 大豆自然老化时间对豆浆稳定性（A）及沉淀性（B）的影响Fig. 3 Effect of soybean natural aging time on the stability (A) and precipitability (B) of soybean milk

由图3A可知，随着大豆自然老化时间的不断延长，豆浆的稳定系数逐渐减小。自然老化超过8 个月后，豆浆的稳定系数下降幅度也逐渐减小，这说明豆浆渐渐趋于稳定。自然老化4、6、8、10 个月后，豆浆的稳定系数分别为0.77、0.74、0.70、0.69，与对照组相比（稳定系数为0.78）其下降幅度分别为1.28%、5.13%、10.26%、11.54%。造成豆浆稳定性下降的原因是大豆在自然老化期间，由于温度和相对湿度的持续作用，导致大豆蛋白质伸展、变性和聚集，降低了蛋白质量浓度，从而使蛋白质分子之间的碰撞机会即交联机会减少，导致网络结构不够紧密，影响其稳定性[23]。同时，豆浆中蛋白质胶粒的带电性也是影响豆浆稳定性的因素之一，大豆贮藏期间蛋白质变性，疏水基团暴露造成了蛋白质胶粒带电性的改变，这在一定程度上也导致了豆浆稳定性的下降[20]。

由图3B可知，随着大豆自然老化时间的延长，豆浆的沉淀率呈现逐渐上升的趋势。当自然老化超过8 个月后，豆浆的沉淀率曲线逐渐趋于平稳，无明显上升，说明豆浆的沉淀性渐渐趋于稳定。对照组的沉淀率最低，为1.23%，自然老化4、6、8、10 个月后，豆浆的沉淀率分别为1.35%、1.47%、1.77%、1.78%，沉淀率分别上升了9.76%、19.51%、43.90%、44.71%。沉淀率的上升是由于大豆自然老化过程中，部分蛋白质在温度和湿度的持续作用下变性聚集，形成大分子的聚集体[24]，而根据Stocks定律，溶液中颗粒的沉降速度与粒径的平方成正比，即粒径越大，沉降速率越快，因此造成豆浆的沉淀率升高[25]。

2.4 大豆自然老化时间对豆浆粒径分布的影响

图4 大豆自然老化时间对豆浆粒径分布的影响Fig. 4 Effect of soybean natural aging time on particle size distribution of soybean milk

豆浆的粒径与其稳定性有关，粒径的减小有助于增加稳定性，并且赋予豆浆更加平滑的口感[26-27]。由图4可知，对照组的大豆所制的豆浆在50.7 nm处出现1个峰，自然老化2、4 个月的大豆所制的豆浆分别在50.9 nm和342.1 nm处出现两个峰；自然老化6 个月的大豆所制的豆浆分别在57.7 nm和342.1 nm处出现两个峰；自然老化8 个月的大豆所制的豆浆分别在60.4 nm和342.1 nm处出现两个峰；自然老化10 个月的大豆所制的豆浆分别在68.1 nm和396.0 nm处出现两个峰；自然老化12 个月的大豆所制的豆浆分别在70.2 nm和396.0 nm处出现两个峰。随着自然老化时间从2 个月延长至12 个月，豆浆粒径分布曲线呈整体右移的趋势，平均粒径也从229.6 nm增至312.9 nm。其原因是大豆在贮藏期间大豆蛋白变性，疏水基团向外伸展，蛋白质分子链展开，乳化脂肪球颗粒水溶性降低，此过程中蛋白质的聚合为主要趋势，同时大豆纤维颗粒的聚集也导致豆浆的粒径增大[10,26]。豆浆的粒径与稳定性密切相关，随着自然老化时间的延长，其粒径增大，导致稳定性降低，与稳定性实验结果一致。

2.5 大豆自然老化时间对豆浆主要风味物质的影响

图5 不同自然老化时间的大豆所制得豆浆的挥发性风味物质总离子流图Fig. 5 Effect of soybean natural aging time on total ion GC-MS profile of soybean milk flavor compounds

表1 大豆自然老化时间对豆浆的挥发性成分及其质量浓度的影响Table1 Effect of soybean natural aging time on the type and amount of volatile components in soybean milk mg/L

采用HS-SPME-GC-MS法提取豆浆中的风味物质的总离子流图如图5所示，其风味化合物的分析结果如表1所示。共检出22 种化合物，其中醛类10 种，醇类5 种，酮类2 种，呋喃类2 种，酯类1 种，其他化合物2 种。自然老化2、4、6、8、10、12 个月的豆浆所检出的共同风味物质12 种，占总风味物质的54.54%。己醛是豆浆豆腥味的主要组成成分[28]，具有非常浓郁的青草气味。由表1可知，随着老化时间的延长，己醛质量浓度整体呈现上升趋势。自然老化12 个月所制豆浆的己醛质量浓度最高，为4.17 mg/L，与对照组相比其质量浓度上升了2.20%，其次是自然老化8 个月和10 个月，均为4.12 mg/L，其余由高到低分别为自然老化6、4、2 个月，己醛质量浓度分别为4.11、4.09、4.03 mg/L。正己醇质量浓度仅次于己醛，这与Xia Yixun等[29]的研究结果一致，而与李景妍[30]、杨蕊莲[31]等的研究结果不一致，这可能是风味物质的萃取方式不同所造成。正己醇具有水果香味[32]，属于非豆腥味物质。随着自然老化时间的延长，正己醇质量浓度整体呈现下降趋势。对照组的正己醇质量浓度最高，为3.57 mg/L，自然老化6、8、10、12 个月后其质量浓度分别为3.49、3.43、3.37、3.34 mg/L，下降幅度分别为2.24%、3.92%、5.60%、6.44%。1-辛烯-3-醇的质量浓度次于己醛和正己醇，其具有蘑菇香味，属于非豆腥味物质[32]。随着老化时间的延长，1-辛烯-3-醇的质量浓度整体呈现下降趋势，与正己醇质量浓度的变化情况相仿。2-戊基呋喃具有青草气味，随着老化时间的延长，其质量浓度呈现下降的趋势，对照组和自然老化2 个月时质量浓度最高，为0.26 mg/L，自然老化12 个月后其质量浓度下降为0.21 mg/L，下降幅度为19.23%。在本实验中未检测出醚类、酸类及烃类物质，可能与HS-SPME萃取头涂层材料有关。

在所检出的22 种风味物质中，有12 种物质的贡献较大，其中己醛、正戊醇、2-戊基呋喃、壬醛、2-己烯醛这5 种化合物具有不愉快气味，对豆腥味贡献较大，而正己醇、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、辛酮、反-2-壬醛、辛醛、反,反-2,4-癸二烯醛这7 种化合物属于非豆腥味物质[29]，具有令人愉快的气味。结合表1可以看出，对照组豆浆共检出16 种化合物，其中己醛、正戊醇、2-戊基呋喃、壬醛、2-己烯醛等具有豆腥味物质的质量浓度总和为5.67 mg/L，而正己醇、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、辛酮、反-2-壬醛、辛醛、反,反-2,4-癸二烯醛这7 种非豆腥味物质质量浓度总和为5.39 mg/L。自然老化2、4、6、8、10、12 个月后，豆腥味物质总质量浓度排名为：自然老化2 个月（5.66 mg/L）＜4 个月（5.78 mg/L）＜6 个月（5.95 mg/L）＜10 个月（6.01 mg/L）＜8 个月（6.05 mg/L）＜12 个月（6.07 mg/L）；非豆腥味物质总质量浓度排名为：自然老化2 个月（5.39 mg/L）＞4 个月＝6 个月（5.38 mg/L）＞8 个月（5.36 mg/L）＞10 个月＝12 个月（5.34 mg/L）。结果表明，随着自然老化时间的延长，豆浆的豆腥味物质质量浓度逐渐增加，而非豆腥味物质质量浓度逐渐下降。综上所述，自然老化时间对豆浆的风味物质有一定的影响，即随着老化时间的延长，豆浆的风味品质下降，这可能是由于大豆自然老化期间其籽粒内不饱和脂肪酸及蛋白质发生了一系列的变化，而目前自然老化时间对豆浆风味物质影响的研究尚鲜见报道，并且豆浆的风味体系十分复杂，其形成机理目前尚未完全清晰，自然老化造成其风味物质变化的原因有待进一步研究。

3 结 论

自然老化是进行大豆贮藏性和品质改良最直接的方式，最终的目的是为了改善豆制品的食用品质，因此，研究自然老化对豆浆的影响具有现实意义。大豆在自然老化期间发生了一系列物理化学变化，导致了所制豆浆的营养成分及风味品质均有一定程度的下降。大豆自然老化6～8 个月期间，豆浆的可溶性固形物、脂肪、蛋白质含量、蛋白质提取率及稳定系数下降幅度最大，分别为1.53%、6.92%、1.70%、0.77%、5.41%，沉淀率上升幅度最大，为20.41%。综合考虑大豆自然老化的质量损失和豆浆的品质指标，建议大豆的贮藏时间应尽可能控制在6 个月内。

本实验只针对自然老化时间对豆浆品质的影响进行了研究，并未对老化的方式、温度、湿度等因素进行研究，为了进一步提高豆浆品质，后续可以继续研究老化的温度和湿度对豆浆的品质影响。