平菇菌糠培养哈茨木霉对植物生长的促进作用1)

温瑞成 蔡静波 李芮 程志强 张建峰 董浩

(吉林农业大学，长春，130118)

长期以来，对于植物病害以及生长状况不佳的情况，人们往往依赖于施用大量的农药和化肥来解决问题。然而，农药的长期使用不仅使有害生物产生抗药性，而且使得益生生物大量死亡，同样化肥的不合理、不科学施用使得化肥被大量浪费并污染农田生态环境[1-2]。因此，研制出更绿色、高效的新型肥料已成为现代农业生产的研究热点之一[3]。近些年来，缓/控释肥、有机肥和生物肥等已成为研究的重点[4]，其中生物肥料功效显著、绿色环保的特点在农业可持续发展中占据了重要地位，产品用途包括促生、生防和降解等多种类型。在我国，微生物肥料的基础研究还很薄弱，在一定程度上限制了我国微生物肥料产业的发展[5]。

平菇(Pleurotusostreatus)为我国栽培和消费最大的菌种之一，其栽培过程剩余的废弃菌糠含有丰富的菌丝体、氨基酸以及次生代谢产物[6]，但这些废弃的菌糠并未得到及时地处理，从而造成浪费和污染。如何合理地利用废弃菌糠变得至关重要[7-8]。已有研究多是将菌糠加工成饲料和用作花土[9-10]。在合适的土壤湿度下菌糠能够显著改善土壤环境中的菌群比例[11]，利用菌糠栽培蔬菜可以促进其优良性状[12]。还有研究利用菌糠培养有益菌种来促进植物营养吸收。例如，利用菌糠培养链霉菌和巨大芽孢杆菌的发酵物促进小白菜的生物量增加[13]。

木霉属(Trichoderma)真菌是重要的生物防治剂，同时也能促进植物的生长[14]。其中哈茨木霉(Trichodermaharzianum)较其他木霉在促生方面有显著效果[15-16]。例如，利用哈茨木霉分生孢子拌施处理下的多种植株均出现不同程度生物量的增加[17]。因木霉制剂多为活菌孢子制剂，受土壤及其各种环境影响干扰使得田间应用效果不稳定[18]，故，本研究采用平菇菌糠培养哈茨木霉，通过正交试验设计优化培养条件，通过补充试验研究其对哈茨木霉产孢的影响，并利用其发酵产物对植物生长的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

哈茨木霉菌株T-22、平菇菌糠、野生型烟草(Nicotianatobacum)、野生型哥伦比亚拟南芥(Arabidopsisthaliana)均由吉林农业大学资源与环境学院提供。

1.2 方法

1.2.1 菌糠木霉最佳发酵条件筛选

(1)哈茨木霉菌的培养。挑取哈茨木霉T-22分生孢子于无菌水中制得孢子悬浮液，吸取50 μL于PDA平板上，涂布静置后于培养箱内28 ℃培养5 d。(2)孢子悬浮液的制备。向平板中加入5 mL无菌水，刷取孢子稀释成107个·mL-1悬浮液。(3)培养基发酵条件筛选。选定接种量、初始含水量、初始pH、温度和培养时间为主要影响因素，进行L16(45)正交设计(表1)，筛选出最佳发酵条件。

表1 L16(45)正交设计

1.2.2 菌糠成分测定

依据GB/T 6432—1994[19]、GB/T 6434—1994[20]、GB/T 6433—1986[21]、GB/T 6438—1992[22]对未使用的菌包、废弃菌糠，以及上述最佳条件处理后的菌糠发酵物洗涤、过滤、干燥后进行成分(粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗灰分)测定(重复5次)，并用SEDX-500型能谱仪(日本岛津)、美国Nicolet 5PC红外光谱仪对其进行能谱(EDS)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析。

1.2.3 木霉产孢量的测定

补充氮源：根据菌糠成分，设计补充氮源来考察对产孢量的影响。由于铵盐是木霉最容易利用的氮源[15]，所以在最佳发酵条件的基础上向其补充不同质量浓度的硝酸铵，并对发酵4、8、12 d后的孢子量进行测定(重复5次)，研究其对木霉产孢量的影响。

补充微量元素：某些微量元素对木霉生长具有重要影响，其中Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+对于哈茨木霉本身具有促进作用，根据补充氮源试验方法检测Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+对哈茨木霉孢子萌发的影响。

1.2.4 拟南芥、烟草发芽率的测定

发酵液的制备：对最佳培养条件得到的发酵物用单层纱布过滤，获得发酵液，并稀释成10倍、20倍、50倍、100倍液。

种子的处理：筛选颗粒大小相近且饱满的拟南芥、烟草种子，用0.1% HgCl2浸泡10 min，蒸馏水冲洗，再分别用不同稀释倍数的发酵液和无菌水在无光条件下浸泡24 h，各选出100粒种子(每处理5次重复)置于湿纱布培养皿中，于28 ℃恒温暗培养，逐日统计平均发芽率。7 d后测定发芽种子的苗长，计算发芽指数和活力指数。发芽指数GI=∑Gt/Dt(Gt为t时间内的发芽数，Dt为相应时间内的发芽数)；活力指数VI=GI×S(S为平均苗长)。

1.2.5 拟南芥、烟草生长状况的测定

将过滤发酵液得到的固型发酵物与栽培土以1∶10比例混匀用以作为栽培拟南芥与烟草的栽培基质，播种已催芽的拟南芥和烟草种子，分期测量拟南芥、烟草植株株高、茎粗、最大叶面积、叶片数、地下部分干质量和第1片真叶总叶绿素质量分数(每处理5次重复)，统计收获种子的总质量。

1.2.6 数据分析

所有的数据均采用Microsoft Excel 2010进行统计整理，并通过SPSS19.0统计软件的单因素方差分析进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 菌糠木霉最佳发酵条件

由表2可以看出，各因素的影响由大到小依次为E、B、D、A、C，其中培养时间和料液比对其影响最大，即培养时间较长，且料液比较高的情况下孢子浓度相对较高，而温度、接种量和pH对其影响不明显，这也间接说明了该菌株对菌糠的适应能力很强。从最大值上看，最佳组合为A3B3C2D3E3，因此最佳发酵条件为，接种量为1.5×108个·mL-1，料液比为1.0 g∶1.5 mL，初始pH为6，培养温度为26 ℃，发酵时间12 d。培养过程中，通过玻璃珠恒温震荡，保证哈茨木霉与菌糠的充分混合，减少试验误差。

表2 平菇菌糠木霉最佳发酵条件的极差分析结果

2.2 菌糠成分

由表3可见，菌糠中的蛋白质量分数较少，在培养木霉的过程中其质量分数明显减少，说明了氮源对木霉生长的重要性。纤维素和灰分在整个环节中均变化显著，粗脂肪也有一定程度的减少。由图1可见，Ca、Mg等微量元素在培养木霉阶段大量积累，说明哈茨木霉在生长过程中需摄入一定Ca、Mg等微量元素供其生长繁殖。由诸多纤维素、半纤维素的特征峰的变化(图2)可以看出，哈茨木霉对纤维素、半纤维素的分解能力极强，进一步说明其适宜在菌糠环境中培养。1 422、1 509 cm-1等峰值的变化很有可能说明，在发酵过程中可能产生一定量的蛋白及其衍生物，这可能对植物的生长、生物防治等方面产生影响。

表3 平菇菌糠成分

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

图1 平菇菌糠成分能谱(EDS)分析结果

图2 平菇菌糠成分傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析结果

2.3 补充氮源对菌糠木霉产孢量的影响

菌糠成分中氮源的含量较低(表3)，因此通过外源补充氮源易促进木霉的发酵和繁殖。由表4可见，补充一定质量浓度的硝酸铵后均可促进孢子量的增加，加入3 g·L-1的硝酸铵培养12 d后是孢子量原来的1.7倍。该结果与FTIR谱图分析相一致，进一步表明纯菌糠培养木霉等对氮元素有所需求的真菌需要补充一定氮源来提高其产量。

表4 硝酸铵质量浓度对菌糠木霉产孢量的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.4 补充微量元素对菌糠木霉产孢量的影响

菌糠的能谱(EDS)分析(图1)表明，菌糠中不仅含有大量的碳源，还含有部分微量元素，通过补充部分微量元素，筛选其最佳补充量。由表5可见，适当的补充微量元素对木霉孢子萌发具有促进作用，其中加入0.500 g·L-1CaCl2、0.800 g·L-1MgSO4、0.015 g·L-1CuSO4、0.025 g·L-1FeSO4对菌糠中的孢子量萌发促进效果最大，但高质量浓度微量元素的添加不仅不能促进孢子萌发，甚至会抑制孢子产生，所以适当的补充微量元素对菌糠木霉的发酵具有重要意义。

表5 补充微量元素对菌糠木霉产孢量的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同一微量元素不同添加量下，木霉产孢量数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.5 菌糠木霉发酵液对拟南芥、烟草发芽率的影响

由表6可见，不同稀释倍数的木霉发酵液对拟南芥和烟草种子的萌发都具有一定作用，其中拟南芥和烟草分别在20倍和10倍稀释液处理下效果最佳，当发酵液稀释倍数更低时对种子的萌发具有一定的抑制作用。所以利用其发酵液催芽时浓度需严格控制。

表6 菌糠木霉发酵物对拟南芥、烟草发芽率的影响

2.6 菌糠木霉固型发酵物对拟南芥、烟草生长的影响

通过在土壤中拌施菌糠木霉固型发酵物的方法培养拟南芥和烟草，结果表明，发酵物对拟南芥和烟草的根系以及植株生长有明显地促进作用，说明菌糠木霉发酵过程产生了一些促进植物生长以及抑制病害的物质，木霉自身在土壤和植物表面的生长也对植株生长起到一定促进作用(表7、图3)。

表7 菌糠木霉固型发酵物对拟南芥和烟草的促生作用

注：除生长时间外，表中数据为平均值±标准差。

3 讨论

本研究利用平菇菌糠作为哈茨木霉培养的基质，其发酵产物在促进种子萌发和植株生长方面成效显著，表明菌糠能为哈茨木霉的生长提供丰富的营养，且哈茨木霉在菌糠培养过程中产生的一些物质能够直接或者间接促进植株生物量的增加。通过对哈茨木霉发酵条件的优化和外源物质的补充试验可以看出，木霉在菌糠中生长要求不高，对含水量有一定需求，能在一定程度上适应温度、pH变化的影响，通过添加适当质量浓度的氮源和一些微量元素促进孢子萌发，而被木霉利用后的菌糠可进一步代谢分解成易于植物吸收的小分子如水溶性有机碳[23]和微量元素，明显提高了菌糠的利用率。在国外20世纪80年代初便能够利用稳定的木霉制剂用于实际生产[24]，而在国内起步较晚，现如今的木霉菌剂多为其分生孢子，成本较高、稳定性差、品种质量参差不齐，导致在农业生产中使用、推广困难，因此，规范市场制度，加强生物肥料的研究至关重要。

通过对3种不同时期的菌糠成分分析，不难看出菌糠本身的营养价值可观，将其合理利用可以降低生产成本。经发酵得到的复合物中纤维素等物质含量变化显著，说明哈茨木霉在发酵过程中生长良好，代谢旺盛，且发酵物中的原基质、菌丝、木霉及其代谢产物在种子萌发、促生，以及生防方面应具有一定作用。研究表明，利用菌糠作为肥料，其中的微量元素较一般有机肥含量更高，其含有的菌丝体对植株的生物防治起到良好的辅助作用，既可改良土壤肥力，又对土壤微生态环境的修复起到积极作用[10]。

A．拟南芥；B.烟草；a.根系；b.整株；c.第1片真叶；d.生长20 d；e-CK.生长40 d(对照)；e.生长40 d。

哈茨木霉与土壤有益微生物之间的相互照应能够刺激植物生长[25]。例如直接施加孢子粉增加番茄等蔬菜种子发芽率和株高等生物量[26]。哈茨木霉通过对根系土壤病原菌的抑制，从而调节土壤微生物群落，以此可达到促进植物生长的作用，同时植物根茎叶上的哈茨木霉亦可刺激植物产生多种防御因子，增强幼苗活力[27]。哈茨木霉本身还对多种植物病原菌具有拮抗作用，在生物防治上应用广泛[28]。哈茨木霉在菌糠中发酵培养后的产物以其独有的综合优势较单纯的分生孢子菌剂促生更适合农业生产上的推广应用。

木霉之所以能够对植物不同器官起到促生作用的机制尚不清楚，国内外大量对木霉促生作用的研究结果差异甚大，甚至相反，缺乏说服力[29]。所以，菌糠木霉发酵物作为生物肥料在促生作用、生物防治以及土壤改良方面上的作用机制仍需进行深入研究，为未来绿色农业生产应用打下夯实的基础。