慢性HBV感染者血清IL-15、外周血恒定自然杀伤T细胞水平变化及临床意义

魏淑琴，赵晓莉，梁霞，刘婷， 肖吉业

(1青岛大学附属青岛市海慈医疗集团，山东青岛266033；2青岛市职业教育公共实训基地)

机体感染HBV后，大多数病毒能够被清除，但部分患者发展成慢性肝炎、重度肝炎、肝硬化，甚至出现原发性肝癌[1～3]。研究发现，机体的免疫功能在肝炎发病过程中发挥重要作用，不同细胞因子之间互相作用，影响机体的防御机制[4]。IL-15作为一种多功能细胞因子，广泛表达于各种细胞和组织中，调节机体的天然免疫和获得性免疫，与HBV感染紧密相关[5]。恒定自然杀伤T细胞(iNKT)是自然杀伤细胞的亚群，影响抗HBV的复制过程[6]。本研究探讨HBV感染者血清IL-15、外周血iNKT水平变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年2月～2017年9月青岛市海慈医疗集团收治的HBV感染者87例，诊断符合中华医学会肝病学分会、感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版)》的标准[7]。其中男52例、女25例，年龄28～45(33.12±6.08)岁，BMI 20.17～24.39(22.26±1.72)；慢性乙型肝炎35例(慢乙肝组)，慢性HBV携带者52例(HBV携带组)；免疫清除期(血清HBsAg、HbeAg、HBV DNA阳性，肝组织学检验结果显示有肝炎)30例，免疫耐受期(血清HBsAg、HbeAg、HBV DNA阳性，血清ALT和AST正常，肝组织学结果无异常)57例；按照2000年《病毒性肝炎防治指南》慢性乙型肝炎病情分类标准[8]：轻度15例，中度11例，重度9例。纳入标准：① HBV DNA阳性；②入组前未接受护肝治疗；③入组前1年内未服用免疫调节剂；④临床资料完整，治疗依从性高；⑤患者及其家属对本研究知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①其他类型的肝炎病毒感染；②酒精性肝炎、溃疡性肠炎、自身免疫性肝炎等；③合并心、肾等重大脏器病变。另选同期体检健康者50例为对照组，其中男36例、女24例，年龄28～47(33.25±6.11)岁，BMI 20.09～24.26(22.13±1.56)。两组性别、年龄、BMI具有可比性。

1.2 血清IL-15、ALT、AST、总胆红素(TBil)检测 所有研究对象抽取空腹肘静脉血4 mL，置于未涂有肝素钠的采血管中，室温下静置20 min，以3 500 r/min离心10 min，分离血清。应用ELISA法检测血清IL-15水平，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，严格按照说明书操作。应用AU-680全自动生化分析仪检测ALT、AST和TBil水平。

1.3 外周血iNKT检测 所有研究对象抽取空腹肘静脉血4 mL，制备新鲜肝素钠抗凝血，将抗凝血与30 mL健康人浓缩白细胞进行混悬，再用34 mL生理盐水稀释，将等体积淋巴细胞分离液缓慢加入到上述混合液中，以800 g速度离心20 min，分离中间的单核细胞层，加入磷酸盐缓冲液；分别以800 g和400 g速度离心15 min和5 min，分离沉淀，获得外周血单核细胞(PBMC)。取400 μL PBMC混悬液，依次加入PMA(1:100)10 μL、BFA(1:10)8 μL和Ionomycin(1:20)8 L，置于培养箱孵育4 h；清洗PBMC并离心，磷酸盐缓冲液100 μL重悬；加入CD3-Per-CP-Cy5-5、TCRVα24-FITC及TCRVβ11-PE各5 μL，室温下避光孵育30 min，固定并破膜；加入磷酸盐缓冲液100 μL重悬细胞，加入5 μL IFN-γ-PE-Cy7、5 μL TNF-α-APC及5 μL IL-4-APC，室温下避光孵育30 min；使用磷酸盐缓冲液冲洗，加入磷酸盐缓冲液重悬细胞400 μL，采用贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪检测CD3+T细胞中的iNKT，计算其比例(外周血iNKT比例)，以及分泌IFN-γ、TNF-α及IL-4的iNKT细胞在总iNKT细胞中的比例(简写为IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例)。鉴定标准：荧光标记结果中CD3+T细胞为黄绿色，iNKT为红色，IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT分别为蓝色、绿色及橙红色。

2 结果

2.1 各组血清指标及外周血各种iNKT比例比较 见表1。

表1 各组血清指标及外周血各种iNKT比例比较

注：与对照相比较，*P<0.05；与HBV携带组比较，#P<0.05。

2.2 不同病情程度慢性肝炎患者各指标比较 随着慢性肝炎病情的加重，患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平逐渐升高，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例逐渐降低，组间比较P均<0.05。见表2。

表2 不同病情程度慢性肝炎患者血清指标及外周血各种iNKT比例比较

注：与轻度比较，*P<0.05；与中度比较，#P<0.05。

2.3 不同免疫期慢性HBV感染患者各指标比较 与免疫耐受期慢性HBV感染患者相比，免疫清除期患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均升高，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均下降，组间比较P均<0.05。见表3。

表3 不同免疫期慢性HBV感染患者血清指标及外周血各种iNKT比例比较

注：与耐受期比较，*P<0.05。

2.4 慢性HBV感染患者血清IL-15、外周血iNKT与其他指标的相关性 慢性HBV感染患者血清IL-15水平与外周血iNKT及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均呈负相关(P均<0.05)，与血清ALT、AST及TBil水平均呈正相关(P均<0.05)；外周血iNKT与IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT均呈正相关(P均<0.05)，与血清ALT、AST及TBil水平均无相关性(P均>0.05)。见表4。

表4 慢性HBV感染患者血清IL-15、外周血iNKT比例与其他指标的相关性

3 讨论

HBV感染机体后是否可被彻底清除、是否转变为慢性肝炎，很大程度上取决于个体的免疫水平[9,10]。病毒的复制过程是免疫应答的重要影响因素，慢性HBV感染的过程一般由免疫耐受的高感染状态转化为免疫清除的低感染状态[9]。乙肝患者肝细胞损伤及炎症反应是免疫细胞影响肝组织的结果[11,12]。HBV感染者细胞免疫应答能力持续下降，HBV感染机体后并不会损伤肝脏，而是通过免疫反应间接对肝脏造成损伤，多种细胞因子构成网络相互影响，加重病理损伤[13,14]。

IL-15是由Grabstein等[15]在1994年发现的多效细胞因子，由单核/巨噬细胞等多种细胞产生，属于螺旋细胞因子家族，其生物学功能丰富，促进淋巴细胞、自然杀伤细胞的增殖和分化，诱导淋巴细胞产生IFN-γ和TNF-α，对机体的天然免疫和获得性免疫过程发挥重要作用。IL-15是重要的抗病毒细胞因子，来源丰富，在多种组织中均有表达，在感染性疾病、血液疾病等的免疫调节方面具有重要作用，在抗肿瘤和器官移植方面也有一定作用[9,16]。肝脏是人体最大的免疫器官，其中iNKT数量丰富。iNKT具有自然杀伤细胞核T淋巴细胞功能，广泛分布在肝、脾、骨髓和外周血中，具有双向调节免疫反应的作用，可用于抑制自身免疫性疾病、感染性疾病及肿瘤的发生发展[17]。

本研究中不同类型慢性HBV感染者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均明显高于对照组，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均低于对照组，与张鑫等[17]的研究结果基本一致。慢性HBV感染者iNKT数量下降，说明机体感染慢性HBV后，iNKT出现耗竭和增殖能力受损[11]。随着慢性肝炎病情的加重，慢性肝炎患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均明显升高，而外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均显著下降，提示血清IL-15水平升高可抑制宿主抗HBV的免疫活性，导致HBV在机体内持续复制和表达，引发肝脏发生慢性损伤。在免疫应答早期，HBV复制水平升高，肝内存在大量的复制型病毒，随着病情的加重，细胞毒性T淋巴细胞破坏感染的肝细胞，降低病毒复制水平[9]。与免疫耐受期患者相比，免疫清除期患者血清IL-15、ALT、AST和TBil水平均明显升高，外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均显著下降，提示血清IL-15和外周血iNKT水平可反映慢性HBV患者的免疫状态。

研究证实，IL-15可诱导T淋巴细胞产生细胞因子及受体的诱导剂，T淋巴细胞只能在获得性免疫过程中被激活，发生于机体免疫反应的晚期，IL-15诱发的细胞免疫启动局部炎症反应[9]，IL-15作为重要的促炎因子，可上调多种免疫细胞释放的炎症介质，加重肝脏的炎症损伤及功能性破坏[18]。机体感染HBV后，激活肝脏内单核/巨噬细胞，增加IL-15的释放量，而高水平的IL-15刺激免疫活性细胞，如T淋巴细胞和自然杀伤细胞等分泌大量的炎症因子，同时通过介导细胞毒性作用参与自身免疫应答反应，诱导肝脏的炎症反应和细胞损伤[18]。iNKT亚群不同，分泌的细胞因子不同，活化的iNKT通过分泌IFN-γ，阻滞HBV的复制过程[17]。慢性HBV感染者血清IL-15和外周血iNKT与分泌各种细胞因子的iNKT及生化指标密切相关，如IL-15促进胸腺NKT前体细胞分化为终末效应NKT，IL-15基因缺陷下调成熟NKT的功能。肿瘤动物模型中NKT功能被抑制，过度表达的IL-15显著提高NKT的抗肿瘤活性[18]。活化的iNKT分泌多种调节免疫应答反应的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-4，激活自然杀伤细胞，并通过穿孔素-颗粒酶途径、Fas/Fas L途径杀伤靶细胞。本研究结果显示，慢性HBV感染患者血清IL-15水平与外周血iNKT比例及IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均呈负相关，与血清ALT、AST及TBil水平均呈正相关；外周血iNKT比例与IFN-γ/iNKT、TNF-α/iNKT、IL-4/iNKT比例均呈正相关。提示IL-15、iNKT及其分泌的细胞因子相互作用，共同促进慢性HBV感染者的疾病进程。

综上所述，慢性HBV感染者血清IL-15水平升高，外周血iNKT数量下降，二者的水平变化与患者者病情及免疫状态密切相关。