黄孢原毛平革菌预处理小麦秸秆制沼气研究

柴春月， 田 龙

(南阳师范学院， 河南 南阳 473061)

黄孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)是白腐菌的一种，具有极强的酵解木质素的作用。它属于担子菌纲非褶菌目伏革科显革菌属。中国秸秆资源丰富，2015年全国秸秆理论资源量为9.6亿t，可收集资源量约为7.6亿t。然而大部分秸秆被废弃或直接焚烧，造成环境污染和资源浪费[1-2]。秸秆是一种优质生物质能，2 t秸秆能源化的热值相当于1 t标准煤[3]。推广秸秆能源化利用，可减少煤、石油等化石能源消耗，改善能源结构，减少二氧化碳排放，缓解全球气候变化等[4]。秸秆可发酵物质含量较高，产沼气潜力较强，但它的木质纤维素结构是生产沼气的瓶颈。降解木质纤维素的关键是去除木质素[5-6]。近年来利用生物法预处理秸秆成为研究热点。生物法常用的是白腐菌[7]。Ghost[8]等发现黄孢原毛平革菌菌丝体有很强的木质素降解能力。黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是白腐菌的一种，降解木质素能力很强，现已成为用于研究生物质利用和自然界有机污染物生物治理的模式生物。本文用黄孢原毛平革菌对秸秆木质纤维素进行降解预处理，研究其对厌氧发酵产沼气的影响，探索小麦秸秆高效产沼气的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦秸秆：收集于南阳郊区，洗净，风干，粉碎，保存。经测定，其总固体含量(TS)为91.45%，主要成分的含量为：纤维素36.5%，半纤维素28.2%，木质素19.6%。菌种：黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，中国工业微生物菌种保藏中心。基础培养液[9]：KH2PO40.20 g· L-1，MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1和1 mL·L-1无机盐溶液，维生素B1100 mg·L-1，吐温-80 0.05%。无机盐溶液[10]：0.50 g·L-1,MnSO4·H2O;0.01 g·L-1，AlK(SO4)2·12 H2O;0.01 g·L-1,H3BO3;0.01 g·L-1,Na2MoO4·2H2O; 0.10 g·L-1,FeSO4·7H2O;0.10 g·L-1,CoCl2·6H2O; 0.10 g·L-1,ZnSO4·7H2O;0.01 g·L-1,CuSO4·5H2O;3.00 g·L-1,MgSO4·7H2O。

厌氧消化试验所用沼液总固体(TS)的含量为4.88%，挥发性固体(VS)为65.43%，pH值为7.73。

1.2 实验方法

1.2.1 秸秆的好氧降解试验

将黄孢原毛平革菌在30℃温度下活化，150 r·min-1转速摇床培养7 d后，用灭菌滤纸过滤，灭菌水冲洗3次，至滤纸不再滴水。称取秸秆40 g于1 000 mL锥形瓶中，按固液比1∶2加入基础培养液，自然pH值，加水调节含水率至75 %，封口后于120℃下灭菌30 min。冷却至室温后以20%的接种量(以湿重计)接种上述过滤得到的菌体，接种后放入恒温恒湿培养箱，调节湿度75 %，好氧条件下，在30℃温度下培养，分别于10 d，15 d，20 d取样，测定纤维素、半纤维素、木质素等指标。每个处理设3个重复。

1.2.2 降解产物的厌氧发酵试验

发酵实验装置见图1。以一个容积为2500 mL 的锥形瓶作为发酵罐，侧壁上共开有两个出口，上方为气样口，下方为液样口，锥形瓶的开口用玻璃管连接集气瓶，集气瓶后连通集液瓶。将发酵罐置于35℃的水浴锅中进行发酵。气体收集瓶容积为2500 mL，采用排水法收集气体，通过测量排出水的体积获得沼气产量。

采用湿发酵方法：取预处理10 d，15 d，25 d后发酵原料(湿料)，加入接种沼液400 g(TS为2.3%)，加水将发酵物总质量调整至600 g，此时发酵罐里的TS负荷均为8%。密封后，35℃±1℃下进行厌氧发酵。对照处理为不加菌体的原料。具体试验设计如表1，每个处理做2个重复。

1.液样口； 2.气样口； 3.恒温水浴锅； 4.导气管； 5.集气瓶； 6.排水管； 7.集液瓶图1 实验装置示意图

表1 厌氧发酵试验设计

1.2.3 测定项目及方法

纤维素、半纤维素和木质素的含量测定采用范氏法[11-12]；产气量的测定采用排水集气法；沼气中甲烷含量的测定采用GC-9890A气相色谱仪分析 (TCD检测器)；干物质的测定采用105℃烘24 h差重法；pH值采用雷磁pHS-2F型酸度计测定；挥发性脂肪酸的测定采用比色法。

1.2.4 数据整理与统计

数据均用SPSS13.0软件进行处理和统计分析。

2 结果与讨论

2.1 降解过程中秸秆木质纤维素含量的变化

由图2可见，黄孢原毛平革菌对木质素、纤维素、半纤维素均有不同程度的降解，对木质素的降解较为明显，接种20 d后，木质素含量分别降到7.3%，降解率为62.75%。木质素、纤维素、半纤维素的降解率均随处理时间延长而增加，20 d后对纤维素的降解率为10.9%，对半纤维素的降解率为17.7%。黄孢原毛平革菌是白腐菌的典型代表，前期实验表明，黄孢原毛平革菌接种浓度过高而会影响木质纤维素的降解效率，过低则会导致其降解效果较差。此外，由于木质素的屏障作用被打破，黄孢原毛平革菌对半纤维的降解能力也有了显著的提高。白腐菌改善了秸秆的结构和质地，有利于释放包裹在木质素和半纤维素中的纤维素，使之变得更容易被消化利用，从而达到提高秸秆消化率的目的。

图2 降解过程中木质纤维素含量的变化

2.2 秸秆厌氧发酵的产酸特征

图3是厌氧发酵中发酵液pH值的变化，各处理在反应过程中秸秆厌氧发酵酸化速度很快，pH值均在第2天就达到最低值，黄孢原毛平革菌预处理10 d，15 d，20 d各组的最低值分别为7.33，7.36，7.28，对照组的最低值为7.15。各处理组的pH值在达到最低值后开始回升，第5 天至第30 天稳定在一定范围内，随后显著下降。

图3 厌氧发酵中发酵液pH值的变化

图4 是厌氧发酵中发酵液中挥发性脂肪酸浓度的变化，可以看出，各处理的挥发性脂肪酸浓度在发酵第2天达到最高，其中黄孢原毛平革菌预处理10 d,15 d,25 d各组的挥发性脂肪酸最高浓度分别为1380 mg·L-1，1025 mg·L-1,1038 mg·L-1。各处理组的挥发性脂肪酸浓度达到最高值后开始下降，在第8天达到一个较低的稳定值，而对照组在第15天才达到较低稳定值，并持续到发酵结束。结合图3可以看出，pH值和挥发性脂肪酸的浓度有着相反的变化趋势，挥发性脂肪酸浓度升高时pH值下降。统计分析可知，挥发性脂肪酸浓度与pH值呈极显著负相关，表明有机酸的产生是造成发酵液中pH值下降的最重要原因。

图4 厌氧发酵中发酵液中挥发性脂肪酸浓度的变化

2.3 秸秆厌氧发酵的产气特征

2.3.1 日产气量

从图5可见，各处理厌氧反应期间的日产气量变化趋势大致相同，均在3～5 d达到第1个产气最高峰，微生物将原料中易利用的成分被快速降解，根据气相色谱，甲烷体积分数低于10%，而二氧化碳约为50%，这与此时系统中发酵型细菌占优势有关。第1个产气高峰之后，产气量下降且持续一段时间，在25～27 d达到第2个产气高峰，此后一直维持在一个较低的产气量水平，直至发酵结束。根据气相色谱测定，发现自第6天开始，生物燃气中甲烷的体积分数均高于50%，说明此时已经进入产甲烷的旺盛期。在整个发酵过程中，出现第1个峰值的原因可能是由于发酵初期，黄袍原毛平革菌的营养相对比较丰富，生长繁殖速度快，从而分泌出大量的木聚糖酶，在此期间由于前期木质纤维素中不仅纤维素和半纤维素得到了有效降解，木质素也有部分被降解;而后期的第2个峰值出现的原因可能与黄抱原毛平革菌的次级代谢有关，在黄抱原毛平革菌的作用下木质素的屏障作用被破坏，有更多的半纤维素可被黄袍原毛平革菌利用。

图5 厌氧发酵过程中日产气量的变化

2.3.2 累积产气量

对各处理在发酵期间的产气进行累积计算，结果见图6。图6显示，对照组在30 d停止产气，而白腐菌预处理10 d，15 d，20 d的处理组则继续产气直至发酵结束。由黄孢原毛平革菌预处理10 d，15 d，累积产气量分别较对照提高了42%，41%。然而，当黄孢原毛平革菌预处理小麦秸秆超过20 d时，木质素、纤维素虽然进一步降解，但其累积产气量下降了37%，这是因为黄孢原毛平革菌预处理秸秆的时间过长，微生物本身生理活动消耗了较多的产沼气底物，同时，它在分解木质素的过程中产生并积累了一些抑制纤维素水解酶活性的代谢产物，从而降低了白腐菌预处理对沼气发酵的促进作用。

图6 厌氧发酵中累积产气量的变化

3 结论

秸秆是典型的木质纤维素，利用纤维素之前必须把它从木质素和半纤维素包裹中释放出来，而半纤维素比木质素易降解，因此，纤维素的分解关键就在于脱除木质素。本文的研究表明，黄孢原毛平革菌对木质素、纤维素、半纤维素均有不同程度的降解，对木质素的降解较为明显。

各处理组与对照组的挥发性脂肪酸含量无显著性差异。对挥发性脂肪酸含量与产气量进一步分析，挥发性脂肪酸的高峰值出现在产气量增加的前期，这是由于有机酸的大量积累造成pH值降低，从而影响了产甲烷菌的活性，但挥发性脂肪酸的积累也为甲烷菌生长繁殖提供了大量的物质来源，随着产甲烷菌活性逐步增加，有机酸底物随后被甲烷菌充分利用后形成了产气高峰。经黄孢原毛平革菌处理小麦秸秆后，木质素、半纤维素、纤维素等发生不同程度的降解，提高了秸秆的沼气产率。