pH、盐度对小球藻生长量和溶氧量的影响

张奇 曹英昆 邢泽宇 梁艳 沈庆洲

摘要：通过对小球藻（Chlorella vlgaris）在不同环境因素pH和盐度条件下，藻液溶氧量和生长量的测定，初步确定小球藻对盐度具有广适性，在0～45的盐度海水中都能生长，其中在盐度为25时溶氧量和生长量达最大，分别为7.65 mg/L和2.65×107个/mL，小球藻在pH为5.5～11.5的环境中可以生存，在pH为9.0时溶氧量和生长量达到最高，分别为8.04 mg/L和2.5×107个/mL，在pH大于11.0时小球藻生长明显减慢，甚至出现死亡现象。

关键词：小球藻（Chlorella vlgaris）；pH；盐度；生长量；溶氧量

中图分类号：Q948.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0083-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.020

Abstract： Based on the use of Chlorella vlgaris in different environmental factors pH and salinity conditions，determination of dissolved oxygen and liquid algae growth， preliminary determination of Chlorella vlgaris has wide adaptability to salinity， growth in 0 to 45 in the salinity of sea water can， in which salinity 25 of the dissolved oxygen and the largest amount of growth to the largest data，the highest value of dissolved oxygen content and growth were 7.65 mg/L and 2.65×107/mL， Chlorella vlgaris at pH 5.5～11.5 environment can survive at pH 9 dissolved oxygen and growth of most high the highest the data here， the highest value of dissolved oxygen content and growth were 8.04 mg/L and 2.5×107/mL， the pH is greater than chlorella growth slowed significantly in 11， and even the phenomenon of death.

Key words： Chlorella vlgaris；pH；salinity；growth；dissolved oxygen

小球藻（Chlorella vlgaris）是一種单细胞藻类，分类学上属于绿藻门（Chlorophyta）、绿藻纲（Chlorophyce-ae）、绿球藻目（Chlorococcales）、小球藻科（Chlor-elaceae）、小球藻属（ChlorelaBeijerinck）[1]。小球藻是微藻的一类，它的直径在3～8 μm。以光合自养生长繁殖，是一种高效的光合植物，分布范围极广，可以在地球上许多地方生存。现在已知约有15种小球藻，其变种可达百种。中国常见的有普通小球藻（Chlorellavlgaris）、椭圆小球藻（Chellipsoidea）和蛋白核小球藻（Chpy-renoidosa）[2]，适宜在人工条件下培养繁殖，规模化、工厂化生产已经实现[3，4]。小球藻含有丰富的营养，富含蛋白质、脂肪和维生素等多种营养物质，具有很高的开发价值，已经应用于多方面，如食品方面有保健食品、食品添加剂，工业方面已开发生物柴油、化工产品等。近年来，微藻开发利用技术发展迅速[4-8]。pH是影响微藻生长的重要因子之一。微藻细胞内有关酶的活性和结构与pH密切相关，pH可以改变水体中有机物的状态和金属复合物的溶解性，对微藻细胞生长和代谢活动产生重要影响[9-12]。藻类是水体中的生产者，进行光合作用吸收CO2和呼吸作用释放CO2，改变水体中的酸碱性，从而影响培养环境中的pH[13]，所以在观测藻类生长速率时，pH是一个重要的指标[14]。大量研究表明，微藻的生长和光合作用与pH密切相关，不同种类的微藻适应生存的pH各不相同[8，15-17]。

为了更加充分利用小球藻，首先要提高小球藻的生产力，增加小球藻的成活率与产量。藻类本身的生理特点以及藻类生长与诸多环境因素有关，其中影响藻类生长的重要环境因素有水体温度、盐度、pH、光照等。对于小球藻的研究，国内外主要集中在一些化学元素以及光合作用等方面。杨桂娟等[18]研究指出小球藻生长量与溶氧量在25 ℃时增长率达到最大。杜宇等[19]提出小球藻在盐度较低的生长环境中生长速度较快，较高盐度时不适宜生长。Rai等[20]研究表明，酸性pH会抑制小球藻的生长、细胞内硝酸还原酶的活性以及对NO3-、NH4+的吸收。Zhang等[21]、张虎等[22]研究指出小球藻的油脂含量在适宜的温度、盐度和pH条件下有所提高。在前人的基础上，本试验利用测定溶液中的溶氧、悬浊液浓度的方法，研究pH和盐度对小球藻生长量和溶氧量的影响，以期了解其特性，研究最佳小球藻生长pH和盐度环境，为优化培养条件提供依据。

1 材料和方法

1.1 藻种

小球藻：采用河北农业大学渤海校区藻种室提供保种于f/2液体培养基的小球藻。

1.2 培养基

采用海水（人工海水）小球藻所用的f/2液体培养基，各组分浓度如表1所示。

1.3 培养条件

经长时间保存的小球藻活力会降低，为提高小球藻活力，试验开始前先进行小球藻活化培养。活化培养方法是将小球藻接种到培养基培养4 d，每天摇晃培养瓶5～8次，以防小球藻下降附着于瓶壁。在25 ℃下培养，光暗周期为14 h∶10 h，用1 L三角瓶培养小球藻，每瓶放藻液1 000 mL。

将进入对数期的藻种转移到洗净后的250 mL锥形瓶，每只锥形瓶接入100 mL小球藻液。将接入小球藻液的锥形瓶放置于光照培养箱内进行培养，其间不换培养液。藻液盐度和pH分别用NaCl和NaOH（0.5 mol/L）以及HCl（0.5 mol/L）调节，为防止藻液pH改变，每隔6 h测定一次并校正，以保证藻液pH在整个试验过程中变化不超过±0.2。转动锥形瓶的位置以使小球藻受到的光照均匀。试验过程中，严格按照无菌操作。

1.4 小球藻生长量的测定

吸取定量培养的小球藻藻液于血球计数板，在显微镜下计数小球藻数量，通过小球藻数量变化来观测小球藻生长量情况。

1.5 藻液溶氧量的测定

采用组装溶解氧测定系统测定藻液溶解氧浓度的变化，该溶解氧测定系统由具有温度自动补偿功能的STARTER300D便携式溶解氧测定仪、磁力搅拌器组成。读取溶解氧测定仪上的读数，即溶解氧浓度DO（mg/L），计算单位时间内溶氧值，取3个相对稳定数据，求平均值。

1.6 不同盐度条件下溶氧量和生长量的测定

设定光照度为7 500 lx、温度为25.0 ℃、pH为7.00±0.05的条件下，测定小球藻的溶氧量和生长量，取对数生长期的小球藻藻液分别加入250 mL的无菌三角瓶中（100 mL藻液/瓶） ，共30瓶，分为10组，每组3次重复，加入NaCl，将10组藻液的盐度分别调为盐度梯度：0、5、10、15、20、25、30、35、40、45。培养12 h后，每4 h测定不同盐度条件下小球藻的溶氧量和生长量。

1.7 不同pH条件下溶氧量和生长量的测定

设定光照度为7 500 lx、温度为25.0 ℃的条件下[18]，测定小球藻的溶氧量和生長量。取对数生长期的小球藻藻液，向灭菌的250 mL三角瓶中放入100 mL藻液，共30瓶，分为10组，每组3个重复，用NaOH和HCl将每组藻液pH分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、10.5、11.0、11.5。在弱光环境中放置12 h，每隔6 h用NaOH和HCl调节藻液的pH，测定前再一次将藻液调为设定的pH。

2 结果与分析

2.1 盐度对小球藻藻液溶氧量的影响

对小球藻藻液进行不同盐度处理，每隔4 h测定其溶解氧量。盐度对小球藻藻液溶氧量的影响如图1所示，小球藻溶液溶氧量在0～45盐度范围内均有不同程度的变化。但盐度在25，时间为12 h时溶氧量达到最高值为7.65 mg/L，在同一盐度下比较3个不同时间点溶解氧都有不同程度增加，不同盐度下的增加程度各不相同。盐度在25左右时，小球藻藻液溶氧量较高，小球藻较适宜生长。

2.2 盐度对小球藻藻液生长量的影响

对小球藻藻液进行不同盐度处理，每隔4 h测定其浓度（小球藻生长量是以其浓度来表示），盐度对小球藻生长量的影响如图2所示，小球藻藻液在0～45盐度范围内均有不同程度的变化。盐度在25，时间为12 h时浓度达到最高值，为2.65×107个/mL，同时在同一盐度下比较3个不同时间点藻液浓度都有不同程度增加，不同盐度下的增加程度各不相同。盐度在25时小球藻藻液浓度较高，小球藻较适宜生长。

小球藻藻液在0～45盐度范围内溶氧量和生长量均有不同程度的增长，其中盐度在25时达到最高，溶氧量和生长量的最高值分别为7.65 mg/L和2.65×107个/mL，分析结果表明，小球藻在盐度为25时的溶氧量和生长量与其他各盐度下溶氧量和生长量之间均存在显著差异（P<0.05） ，这说明该小球藻生长的较适盐度为25。

2.3 pH对小球藻藻液溶氧量的影响

对小球藻藻液进行不同pH处理，每隔4 h测定其溶解氧量，pH对小球藻藻液溶氧量的影响如图3所示。小球藻溶液溶氧量在pH为5.5～11.5范围内均有不同程度的变化。pH在9.0，时间为12 h时溶氧量达到最高值，为8.04 mg/L，在同一pH下比较3个不同时间点溶氧量都有不同程度增加，不同pH下的增加程度各不相同。pH在9.0时小球藻藻液溶氧量较高，小球藻较适宜生长。

2.4 pH对小球藻藻液生长量的影响

将小球藻藻液以不同的pH处理，每隔4 h测定其浓度（小球藻生长量是以其浓度来表示），pH对小球藻生长量的影响如图4所示。小球藻藻液在pH为5.5～11.5均有不同程度的变化。pH在9.0，时间为12 h时浓度达到最高值，为2.5×107个/mL，同一pH下比较3个不同时间点藻液浓度都有不同程度增加，不同pH下的增加程度各不相同。pH在9.0时小球藻藻液浓度较高，小球藻较适宜生长。

小球藻藻液pH在5.5～11.5溶氧量和生长量均有不同程度的变化，其中pH在9.0时达到最高，溶氧量和生长量的最高值，分别为8.04 mg/L和2.5×107个/mL，分析结果表明，小球藻在pH为9.0时的溶氧量和生长量与其他各pH下溶氧量和生长量之间均存在显著差异（P<0.05），这说明该小球藻生长的较适pH为9.0。

3 讨论与结论

3.1 盐度对小球藻生长的影响

盐度通过改变微藻细胞内外的渗透压，对微藻叶绿素含量、光合作用和代谢产生一定作用[23]。本试验分析了盐度对小球藻藻液在溶氧量和生长量方面的影响。Jin[24]提出单细胞藻类生长在盐度作用下呈抛物线，过低或过高的盐度都会影响藻类生长。刘加慧等[25]指出盐度在15～30时小球藻生长速率呈上升趋势，在30～45时生长速率呈下降趋势，与本研究结果相似。朱晓艳等[26]提出小球藻在较低盐度下适宜生长，在高盐度下抑制生长。本试验表明，在0～45盐度溶氧量和生长量均有不同程度的增长，从低盐度到高盐度，小球藻溶氧量和生长量呈抛物线变化，其中盐度在25时达到最高，表明小球藻较适宜生长。

3.2 pH对小球藻生长的影响

pH是影响微藻生长的重要因子之一。本研究通过探究pH对小球藻藻液在溶氧量和生长量方面的影响来研究pH对小球藻生长的影响。刘加慧等[25]研究指出pH对小球藻有显著影响，朱晓艳等[26]研究表明小球藻在pH为8的条件下净光合放氧速率最大，适合在弱碱环境中生长，与本研究结果相符。这些研究结果都表明小球藻适宜生长在弱碱环境中。试验表明，pH在5.5～11.5的范围内溶氧量和生长量均有不同程度的变化，pH从低到高，小球藻溶氧量和生长量呈抛物线变化，其中pH在9.0时达到最高，表明小球藻较适宜在弱碱环境中生长。

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