具有抗菌活性的水杉内生真菌的分离及筛选

张垚 白金峰 徐凯莉 刘宁

摘要：从水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）树皮、叶片中分离筛选得到了17株形态各不相同的内生真菌，采用对峙培养法筛选对植物病原真菌，层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）﹑禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）﹑玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）﹑玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）具有拮抗作用的菌株，筛选得到了1株对以上4种病原菌具有广谱抗菌活性的菌株，命名为SS-17。通过对SS-17菌株的形态特征观察及ITS分子鉴定，初步鉴定为黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

关键词：水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）；内生真菌；筛选；抑菌活性；黑附球菌（Epicoccum nigrum）

中图分类号：Q939.92 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0036-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.008

Abstract： In this research，17 strains of the endophytic fungi were separated from the leaves and bark of Metasequoia glyptostroboides with different colony morphology，and the strains with antagonistic action were screened by dual culture method against plant pathogenic fungi including Fusarium proliferatum，F. graminearum，Setosphaeria turcica，Helminthosporium maydis. 1 strain was obtaind with antagonism to these strains above，named SS-17. With the morphology and ITS molecular identification of SS-17 strain，it was identified as Epicoccum nigrum.

Key words： Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng；endophytic fungus；screening；antibacterial activity；Epicoccum nigrum

水杉（Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng）是杉科水杉属植物，是中国独有的植物种类。它同时也是一种罕见的植物种类，被称为“活化石”，它对古植物、古地理等的研究均有重要意义[1]。目前，人们对水杉的生态习性、病虫害防治等方面已经进行了广泛深入地研究[2-4]。近些年来，对水杉的生物活性的研究引起了人们的广泛关注，2005年樊兵等[5]发现了水杉具有抗植物病毒的活性。吴光旭等[6]发现水杉茎叶提取物浓度是0.01 g/mL时，对霜疫霉孢子囊的萌发抑制率超过50%，并且对香蕉炭疽病菌也有一定的抑制作用。

植物内生真菌是指生存在植物组织内部或者生活史的某一阶段存在于植物组织内部，并不会对植物组织致病的一类真菌[7，8]。目前，從已研究过的各类植物中都发现了内生真菌，对药用植物中的植物内生真菌的研究较多，当前发现的内生真菌主要为子囊菌类及其无性型，包括腔菌纲、核菌纲等[9-11]。从植物内生真菌的次生代谢产物中分离得到的化合物具有抗菌、杀虫、抗肿瘤等生物活性[12] 。Guo等[13]从栎属（Quercus）植物中分离得到了一株内生真菌Cytonaema sp.，其代谢产物可以抑制人巨细胞病毒蛋白酶的活性，从而达到抑制感染性人巨细胞病毒颗粒产生的作用。有些内生真菌还能够产生细胞壁分解酶，用来克服宿主防御异物的天然屏障，还可以产生纤维素酶、果胶酶等[14]。研究还发现，植物内生真菌还能够产生其他活性物质，如免疫抑制剂、降血糖活性物质等。

本试验从水杉树皮、叶片中分离筛选得到形态各不相同的内生真菌，采用对峙培养法筛选对植物病原真菌层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）﹑禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）﹑玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）﹑玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）具有拮抗作用的菌株，对其进行形态及分子生物学鉴定，为植物病害防治提供菌种来源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

PDA培养基，LB培养基。

1.2 样品采集

2014年5月28日在河北农业大学西校区进行采集水杉树皮和叶片。采集部位和方法：用小刀刮取靠近水杉根部约20 cm的树皮，再用小刀剪取水杉叶片。分别用无菌袋装好后进行编号，用于内生真菌的分离或者存于4 ℃冰箱备用。

1.3 试验方法

1.3.1 内生真菌的分离与纯化 将表面消毒处理后的树皮及叶片接种于含150 μL氨苄青霉素（ampcilin）的PDA培养基上，25 ℃倒置培养，培养3～5 d后，选择长势较好的菌丝，挑取菌丝接于新鲜的PDA培养基中，25 ℃倒置培养，根据菌落形态特征挑取不同形态及位置的单菌落，于PDA培养基25 ℃倒置纯化培养，获得性状稳定的内生真菌并编号，在4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 内生真菌的分子生物学鉴定 用CTAB法提取形态各不相同的菌株的DNA，用ITS（ITS1、ITS4）通用引物进行PCR扩增，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.3 拮抗菌活性的测定 采用对峙培养法，在超净工作台中，将直径为5 mm的供试病原真菌的菌块接种于PDA培养基的内部，再将直径为5 mm的植物内生真菌的菌块接种于供试病原菌的左侧。将只含有供试病原真菌的PDA培养基作为空白对照，25 ℃培养箱中倒置培养，培养3～5 d，测量供试病原菌菌落边缘和植物内生真菌菌落边缘之间的距离，选择拮抗作用较明显的菌株进行复筛和鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

将水杉树皮和叶片表面消毒后，分离植物内生真菌。经过分离单菌落、纯化培养，3代以上得到性状稳定的内生真菌，共分离得到17株形态各不相同的菌株。采用对峙培养法，在超净工作台中，将直径为5 mm的供试病原真菌的菌块接种于PDA培养基。

2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用及抗菌谱

将从水杉树皮及叶片中分离纯化得到的17株内生真菌，通过对峙培养法，筛选对层出镰刀菌﹑禾谷镰孢菌﹑玉米大斑病菌﹑玉米小斑病菌4种供试病原真菌具有拮抗作用的菌株，结果见图1。由图1可知，菌株SS-17对以上4种病原菌均具有较强的拮抗作用。

2.3 SS-17菌株的鉴定

SS-17菌株在PDA培养基上，25 ℃倒置培养下，前期长出棉絮状白色菌丝，菌丝由中心向边沿扩展生长，呈“V”形，培养5 d后菌丝长满皿，开始分泌黄褐色分泌物，菌落背面黄褐色，中心呈黑色，菌落的边缘不整齐，如图2所示。

在光学显微镜下观察SS-17菌株的孢子和菌丝的形态特征，结果如图3所示，SS-17菌丝多为无色或呈极淡褐色，分枝少、光滑，菌丝内有隔膜，分生孢子梗短小且粗，分生孢子从分生孢子梗顶端膨大的地方生出，分生孢子的颜色初期较浅，后期颜色加深为黑褐色。综合形态特征及序列比较，初步鉴定该菌株为半知菌纲壳霉目杯霉科黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

用CTAB法提取SS-17菌株的DNA作为模板，用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，扩增产物回收进行测序。使用MEGA5.1软件，按邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，如图4所示。结果显示，在水杉中分离得到的SS-17菌株与黑附球菌聚于相同进化支。综合形态特征及ITS序列比对结果，鉴定该菌株为黑附球菌（E. nigrum）。

3 讨论

黑附球菌属半知菌亚门附球菌属，广泛地存在于土壤、空气及刚死亡或幼嫩的植物组织表面，还可以作为寄生菌寄生在某些植物病原菌上，如小麥（Cochliobolus sativus）。黑附球菌大多数没有致病性，但对沙棘果[15]、小麦[16]有一定的致病力，Hensel[17]和Ohtsubo[18]等认为，它可能是一种过敏原，其培养液提取物对小鼠有一定毒性。本试验从水杉树皮中分离筛选得到17株内生真菌，通过抑菌试验筛选出SS-17菌株有较强的拮抗作用，利用形态观察和ITS分子鉴定，发现该菌株ITS序列与附黑球菌同源性高，初步鉴定该菌株为黑附球菌。

黑附球菌可以在衰老的或刚死亡的植物组织表面快速地产生分生孢子，并能够产生可以抗真菌的化合物，因此，它是一种防治农作物病害较为理想的生防菌[19]。Liu等[20]试验结果显示，黑附球菌的发酵液经去除多糖后的余液可以抑制病疫霉孢子囊释放游动孢子。已有研究表明，黑附球菌产生的酶类物质的主要作用为降低这些菌类细胞膜的通透性，或者干扰周围其他菌类及降解其细胞壁的化学成分。

随着生物技术迅速的发展，基因工程技术等相关手段被用于筛选耐化学药剂、具有高产率的黑附球菌，从而为其开发和利用提供良好的材料。目前，发酵体系是黑附球菌的利用基础，因此摸索并建立适合黑附球菌的不同菌株的发酵体系，具有很重要的理论和现实意义。关于生防菌附球菌和病原菌之间的互作机制还不是很清楚，这对于黑附球菌的生物防治作用的提高极其重要，需要进一步深入研究；对其次生代谢产物的分离和提取，也是将来研究的主要方向。

4 结论

本试验从水杉叶片及树皮中分离筛选得到17株菌落形态不同的内生真菌；通过对峙培养，筛选得到的SS-17菌株对层出镰刀菌﹑禾谷镰刀菌﹑玉米大斑病菌﹑玉米小斑病菌具有较强的拮抗作用；通过对SS-17菌株的形态特征观察及ITS分子鉴定，鉴定该菌株为黑附球菌。

参考文献：

[1] 马金双.水杉发现大事记-六十年的回顾[J].植物杂志，2003（3）：37-40.

[2] 黄宏文，李晓东，李建强.孑遗植物水杉的遗传多样性研究[J].生物多样性，2003，11（2）：100-108.

[3] 于泽波.水杉的繁殖栽培[J].北方园艺，2008（6）：168-169.

[4] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京：科学出版社，1994.

[5] 樊 兵，吴云锋，袁耀锋，等.植物源抗病毒活性物质的初步筛选[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005，33（增刊）：167-170.

[6] 吴光旭，杨小玲，刘爱媛，等.64种植物提取物的离体抗真菌活性评价[J].长江大学学报（自然科学版），2005，2（2）：77-82.

[7] 吴静萍，郑师章.密花石斛菌根菌分离鉴定及其代谢产物的测定[J].复旦学报（自然科学版），1994，33（5）：547-552.

[8] STROBEL G，STIERLE A，STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomycetes andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science，1993，260（5150）：214-216.

[9] SAIKONEN K，WALI P，HELANDER M，et al. Evolution of endophyte-plant symbioses[J].Trends in Plant Science，2004，9（6）：275-280.

[10] KUKLINSKY S J，ARANJO W L，MEXES R，et al. Isolation and characterizalion of excphytic bacteria from soybean（Glycine max） grown in soil treated with glyphosate herbicide[J].Plant and Soil，2005，237（1-2）：91-99.

[11] 邹文欣，谭仁祥.植物内生菌研究进展[J].植物学报，2001，43（9）：881-892.

[12] 易晓华.植物内生真菌次生代谢产物研究进展[J].中国农学通报，2009，25（21）：255-260.

[13] GUO B Y，DAI J R，NG S，et al. Cytonic acids A and B：Novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species[J].Journal of Natural Products，2000， 63（5）：602-604.

[14] 杨春平，陈华保，吴文君，等.植物内生真菌次生代谢产物的多样性及潜在应用价值[J].西北农业学报，2005，14（2）：126-132.

[15] PAUL Y S，THAKUR B R，SINGH V.不同储存条件下沙棘果采收后腐爛情况研究[J].国际沙棘研究与开发，2004（4）：1-3.

[16] WEBER R，KITA W. Variability of the occurrence of Epicoccum nigrum on grain of three cultivars of winter wheat depending on cultivation system and stubble height[J].Journal of Range Management，2013，30（3）：227-230.

[17] HENSEL H M，PRINCE H E，MEYER G H. Studies with two genera of tuberculariaceae：Epicoccum and fusarium[J].Ann Allergy，1974，32（3）：121-126.

[18] OHTSUBO K，SAITO M，ISHIKO T，et al. Toxicity to mice and HeLa cells and preliminary chemical examination of five fungi isolated from foodstuffs[J]. The Japanese Journal of Experimental Medicine，1978，48（3）：257-264.

[19] BROWN A E，FINLAY R，WARD J S. Antifungal compounds produced by Epicoccum purpurascens against soil-borne plant pathogenic fungi[J].Soil Biology & Biochemistry，1987，19（6）：657-664.

[20] LIU X Y，HU T，CAO K Q. Biological characteristics of strain F603 of Epicoccon sp.，an antagonistic fugus for controlling Phytophthora infestans[J].Frontiers of Agriculture in China，2007，1（2）：175-178.