粉碎细度对桑叶粉功能成分溶出的影响

李 玲 丁晓雯 赵 威 张高军 黄先智

(1. 西南大学生物技术学院，重庆 400715；2. 西南大学食品科学学院，重庆 400715;3. 西南大学蚕学与生物系统研究所，重庆 400715)

桑叶为桑科植物桑(MorusalbaL.)的叶，现代药理研究[1]证明，桑叶含有黄酮、多酚、多糖、氨基酸、DNJ、膳食纤维等活性物质，有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗菌和抗病毒等多种药理活性。目前中国的桑叶类保健产品主要是桑叶茶、桑叶咀嚼片、桑叶干粉、桑叶挂面等，不为大众所熟知[2]，桑叶开发尚有巨大的发展空间。

桑叶的细胞壁结构使桑叶中的活性成分要经过浸润、溶胀、渗透和扩散等几个步骤才可以溶出[3]，限制了桑叶有效成分的利用率，将桑叶粉碎是提高其溶出率的有效途径[4]。超微粉碎是指将物料粉碎至10～25m大小颗粒的新技术，可以加快功能成分溶出效率[5]。研究[6-7]表明，超微粉碎可以显著降低桑叶粉粒径，增加蛋白质、多糖与钙溶解性，但对其他有效成分的研究较少。

本试验通过研究3种细度桑叶粉的DNJ、黄酮、总酚、多糖、氨基酸和膳食纤维的溶出情况，为其大规模开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料

桑叶粉：3种细度的胜利大叶桑叶粉，由西南大学家蚕基因组生物学重点实验室提供。

1.2 试验试剂与仪器

DNJ标准品、芦丁标准品、没食子酸标准品：北京世纪奥科生物技术有限公司；

高效液相色谱仪：LC-20A型，日本岛津公司；

全自动凯氏定氮仪：UDK132型，意大利VELP公司。

1.3 试验方法

1.3.1 粒径分布与显微结构的测定 取0.01 g桑叶粉样品置于载玻片上，滴1滴稀甘油分散，使用显微镜法测量粒径并观察纤维特征[8]。

1.3.2 DNJ的测定

(1) 配制1-DNJ标准溶液：0，5，10，15，20，25，30 μg/mL。

(2) 制备待测样品：每个待测样本称取6份，每份0.5 g，分别加入35 mL超纯水，80 ℃水浴浸提20，40，60，80，100，120 min(每20 min振摇1次)，使用10～15 μm孔径的慢速定性滤纸抽滤，滤渣再加15 mL超纯水重复提取1次，合并2次滤液用超纯水定容至50 mL。DNJ测定方法参考文献[9]。

1.3.3 黄酮的测定

(1) 配置芦丁标准溶液：0，50，150，250，350，450 μg/mL。

(2) 制备待测样品：每个待测样本称取6份，每份1.0 g，加入30 mL甲醇，60 ℃水浴条件下分别浸提10，20，30，40，50，60 min，10～15 μm孔径的慢速定性滤纸抽滤，滤渣再重复提取2次，合并滤液，以甲醇定容至100 mL。黄酮测定方法参考文献[10]。

1.3.4 总酚的测定

(1) 配置没食子酸标准溶液：0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/mL。

(2) 制备待测样品：每个桑叶样品准确称取6份，每份1.0 g，加入100 mL纯水摇匀，室温分别浸提0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，10～15 μm孔径的慢速定性滤纸抽滤，纯水定容至100 mL。总酚测定方法参考文献[11]。

1.3.5 多糖的测定

(1) 配制葡萄糖标准溶液：1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 μg/mL。

(2) 制备待测样品：每个样称取6份，每份0.25 g，加入25 mL的沸纯水，80 ℃水浴提取20，40，60，90，120，180 min，10～15 μm孔径的慢速定性滤纸抽滤，取滤液用纯水定容至25 mL。取1.0 mL滤液于50 mL容量瓶中，用纯水定容。多糖测定方法参考文献[12]。

1.3.6 氨基酸态氮的测定 按GB/T 5009.235—2016执行。

1.3.7 膳食纤维的测定 按GB 5009.88—2014执行。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 不同细度桑叶粉的粒径与显微形态

2.1.1 粒径 粉碎可以分为粗粉碎、细粉碎、微粉碎、超微粉碎，其成品粒度分别为5～10 mm、0.1～5.0 mm、<100 μm、10～25 μm[13]。本试验所用桑叶粉的粒径分布见表1。

表1 桑叶粉的粒径Table 1 The particle size of mulberry leaves

根据粒径分析的结果，细粉、微粉和超微粉的D50%分别为101.00，13.31，8.70 μm，3种桑叶粉分别符合细粉碎、微粉碎和超微粉碎的成品粒度级别，可以将桑叶粉1号归为细粉、2号归为微粉，3号归为超微粉。

与细粉比较，微粉、超微粉的粒径分别减小58.30%，72.22%；微粉和超微粉的峰度分别增大62.92%，183.71%，峰度增大表示粉碎后粉体粒径分布更集中。粉碎后微粉与超微粉粒径的全距分别减小88.74%，93.11%，表示粉碎后粉体粒径的分布范围更狭窄，粉体更均匀。

2.1.2 显微形态 图1显示，在显微镜下桑叶细粉中可见较大的组织块，这些组织块由很多结构完整的细胞组成，表示细粉的粉碎未达到使细胞破碎的程度；微粉中偶见多细胞的组织残片，少量的细胞碎片散布周围，达到部分细胞破碎的程度；而超微粉中未见细胞群，只有散落的细胞残片，没有完整的细胞结构存在，达到了细胞破碎级别。

图1 3种桑叶粉的显微形态Figure 1 Microscopic morphology of three kinds of mulberry leaf (×200)

2.2 不同细度桑叶粉的化学成分溶出量

2.2.1 DNJ溶出量 DNJ是在桑树中发现的一种生物碱，已被证明可以通过抑制α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等糖代谢酶，显著延缓多糖的降解过程[14]，有降血糖、抗病毒和抗肿瘤转移的作用[15]。测定了3个不同细度桑叶粉的DNJ溶出量，进行了3次重复，结果见图2与表2。

如图2所示，在各个提取时间，超微粉和微粉的DNJ溶出量都高于细粉。表2显示，与桑叶细粉相比，微粉、超微粉的DNJ平均溶出量与最大溶出量均极显著增大(P<0.01)；与微粉相比，超微粉的最大溶出量显著增大(P<0.05)，但二者的平均溶出量无显著性差异(P>0.05)。表明粉碎可以提高桑叶粉的DNJ溶出量。

图2 不同细度桑叶粉DNJ的溶出量Figure 2 Contents of DNJ in different fineness mulberry leaf表2 不同细度桑叶粉DNJ溶出数据统计†Table 2 The data statistics of DNJ dissolves

分组平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)与提取时间相关系数相关显著性(P值)细粉 0.90±0.15A1.06±0.01A0.9520.000微粉 2.02±0.73 B2.18±0.03Ba0.5260.025超微粉2.20±0.16B2.28±0.04Bb0.1040.682

† 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

图2显示，随着提取时间的延长，细粉的DNJ溶出呈现先增加后趋于平缓的趋势，微粉和超微粉的DNJ溶出初始阶段增幅比细粉小，提取时间的延长对DNJ溶出影响不大。表2显示，细粉中的DNJ溶出与提取时间极显著相关，相关系数为0.952，微粉的DNJ溶出与提取时间极显著相关，相关系数比细粉小，为0.526，超微粉的DNJ溶出与提取时间没有显著性相关关系。表明粉碎可以使桑叶粉的DNJ在较短时间内达到溶出峰值。

2.2.2 黄酮溶出量 黄酮类物质是桑叶的主要活性成分之一，被证明具有明显的降血脂、降血糖、降血压、抗氧化作用[16]，对于高脂血症诱导的糖尿病及心血管系统疾病有一定防治作用[17]。测定了3个不同细度桑叶粉的黄酮溶出量，进行了3次重复，结果见图3与表3。

图3显示，在不同提取时间，桑叶细粉、微粉、超微粉的黄酮溶出量始终呈现出细粉<微粉<超微粉，超微粉的黄酮溶出量始终大约是细粉的2倍。由表3可知，3种细度的桑叶粉的黄酮平均溶出量在各提取时间内的均值均有极显著性差异(P<0.01)；微粉和超微粉的黄酮最大溶出量都极显著大于细粉的(P<0.01)，但二者之间无显著性差异(P>0.05)。表明粉碎可以提高桑叶粉的黄酮溶出量。由图3可知，随着提取时间的延长，3种细度桑叶粉的黄酮溶出量均呈现出先增加后趋于平缓的趋势，提取时间在40 min后，3种桑叶粉的黄酮溶出量稳定在了最大值。微粉的黄酮溶出量在提取时间为30 min内与细粉接近，40 min后与超微粉接近。表3还可以看到，三者的黄酮溶出量与提取时间都极显著相关(P<0.01)，但细粉的相关系数大于微粉和超微粉的。表明粉碎可以提高桑叶粉中黄酮的溶出效率。

图3 不同细度桑叶粉的黄酮溶出量Figure 3 Contents of flavone in different fineness mulberry leaf表3 不同细度桑叶粉黄酮溶出数据统计†Table 3 The data statistics of flavone dissolves in different fineness mulberry leaf

分组平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)与提取时间相关系数相关显著性(P值)细粉 0.53±0.07A0.59±0.03 A0.9240.000微粉 0.63±0.11B0.75±0.02B0.8760.000超微粉0.72±0.07C0.78±0.03B0.8310.000

† 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2.3 总酚溶出量 桑叶中的多酚类化合物可以清除体内过剩的自由基，防止细胞组织受到氧化伤害，达到抗衰老、抗辐射、防治肿瘤及增加机体免疫力等效果[18]。测定了3个不同细度桑叶粉的总酚溶出量，进行了3次重复，结果见图4与表4。

图4 不同细度桑叶粉的总酚溶出量Figure 4 Contents of total phenols in different fineness mulberry leaf表4 不同细度桑叶粉总酚溶出数据统计†Table 4 The data statistics of total phenols dissolves in different fineness mulberry leaf

分组平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)与提取时间相关系数相关显著性(P值)细粉 7.35±0.16A7.53±0.07a0.7090.001微粉 7.50±0.09B7.57±0.120.1610.523超微粉7.84±0.09C7.80±0.14 b0.0240.923

† 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由图4可知，在不同的提取时间下，桑叶粉的总酚溶出始终遵循细粉<微粉<超微粉的规律。表4显示，3种细度的桑叶粉总酚的平均溶出均有极显著性差异(P<0.01)；超微粉的总酚最大溶出量显著高于细粉(P<0.05)的。表明粉碎可以增大桑叶粉中的总酚在各提取时间内的平均溶出量，对其最大溶出量影响较小。

图4与表4显示，细粉的总酚溶出量与提取时间极显著相关(P<0.01)，提取时间越长总酚溶出量越大；而微粉和超微粉的总酚溶出量与提取时间没有显著相关关系(P>0.05)，在初始提取时间(0.5 h)即可达到溶出峰值。因此，粉碎可以使桑叶总酚在较短时间达到最大溶出量，提高溶出效率。

2.2.4 多糖溶出量 桑叶多糖具有显著的调节糖代谢、降血糖和抑制血脂升高的作用[19]，而且具有抗氧化性，对DPPH·和OH·具有显著清除作用[20]。测定了3个不同细度桑叶粉的多糖溶出量，进行了3次重复，结果见图5与表5。

图5 不同细度桑叶粉的多糖溶出量Figure 5 Contents of polysaccharide in different fineness mulberry leaf表5 不同细度桑叶粉多糖溶出数据统计†Table 5 The data statistics of polysaccharide dissolves in different fineness mulberry leaf

分组平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)与提取时间相关系数相关显著性(P值)细粉 8.55±4.54A16.17±0.53A0.8930.000微粉 15.09±4.19 Ba19.21±0.42 Ba0.9500.000超微粉18.27±3.44 Bb22.08±0.94 Bb0.9390.000

† 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

图5显示，粒度越小，桑叶粉中的多糖溶出量越多，呈现细粉<微粉<超微粉的规律。从表5中可以看到，微粉和超微粉的多糖平均溶出量与最大溶出量均极显著大于细粉(P<0.01)，超微粉的多糖平均溶出量与最大溶出量均显著大于微粉(P<0.05)。表明粉碎可以提高桑叶粉中多糖的溶出量。

随着提取时间的延长，各细度桑叶粉的多糖溶出量均有不同程度上升，细粉的多糖溶出量在提取时间终点180 min时趋于平衡，而微粉、超微粉分别在90，60 min时趋于平衡，因此达到平衡所需要的时间细粉>微粉>超微粉，显示粉碎可以加快多糖溶出速率。

DNJ、黄酮、总酚、多糖的溶出量经过粉体提高的原因可能是：① 小颗粒与溶剂的接触面积较大，在相同的时间内可以溶出更多的有效成分；② 桑叶粉中的有效成分在溶出的过程中，首先需要吸水溶胀，然后通过简单扩散的方式逐步扩散到浓度较低的外层细胞，若颗粒较大，则其中的有效成分需要经过几十层的“障碍”才可以溶出至溶剂，简单扩散的速度依赖于各级细胞间的浓度差，达到溶出最大值时简单扩散不再发生，溶剂与各级细胞间浓度差消失，细胞内的有效成分浓度等于溶剂内的有效成分浓度，过滤后，滤渣中残留的有效成分会损失。超微粉碎使细胞破碎，这些破碎的细胞没有胞内浓度差，在溶出终点过滤的时候不会截留有效成分。因此增大了DNJ、黄酮、总酚、多糖的最大溶出量。

2.2.5 氨基酸态氮溶出量 桑叶中含有丰富的氨基酸，干物质中的含量约为21%～27%[21]。测定了3个不同细度桑叶粉的氨基酸态氮溶出量，进行了3次重复，结果见表6。

表6 不同细度桑叶粉的氨基酸态氮溶出量†Table 6 Contents of amino acid nitrogen in different fineness mulberry leaf

† 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表6可知，3种细度桑叶粉的氨基酸态氮溶出均有极显著性差异(P<0.01)，粉碎提高了桑叶粉的氨基酸态氮溶出量。桑叶中大部分的氨基酸以蛋白质大分子的形式存在，游离的氨基酸比较少，经过粉碎后部分大分子的蛋白质结构遭到破坏，释放出了游离氨基酸，有利于动物对于氨基酸的吸收。

2.2.6 膳食纤维含量 测定了3个不同细度桑叶粉的膳食纤维含量，进行了3次重复，结果见表7。

表7 不同细度桑叶粉的膳食纤维含量†Table 7 Dietary fiber content of different fineness mulberry leaf powder g/100 g

† 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表7显示，随着桑叶粉细度的减小，总膳食纤维(DF)，可溶性膳食纤维(SDF)含量增大，不溶性膳食纤维(IDF)含量减小，三者均具有极显著性差异(P<0.01)。显示粉碎可以增加膳食纤维与可溶性膳食纤维含量，减少不溶性膳食纤维含量。

原因可能是不溶的大分子IDF结构在粉碎过程中遭到破坏，转变为可溶的小分子SDF，因此IDF含量减少，而SDF含量增大；还可能是粉碎破坏了植物细胞结构，使得SDF更容易在膳食纤维测定中的酶解过程解离出来，造成SDF含量增加。

3 结论

粉碎可以使桑叶粉中DNJ、黄酮、总酚、多糖的溶出量显著增大(P<0.05)，氨基酸态氮、可溶性膳食纤维、总膳食纤维含量显著增大(P<0.05)，不溶性膳食纤维含量减小(P<0.05)。综上，粉碎有利于桑叶粉的有效成分溶出，提高桑叶粉利用率。但是，本研究中不同成分溶出情况是在该成分的最佳提取试剂中测定的，在人体胃肠道中溶出的情况还需要进一步探讨。