樟树叶多酚抑菌活性及在冷藏草鱼肉保鲜中的应用

李应洪 李忠海 付湘晋 张 慧

(中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

中国樟树资源丰富，目前主要是用于绿化、木料加工及提取芳樟油，大量加工下脚料(枝、叶)未被利用。樟树叶含有大量酚类物质，是新的多酚资源[1-2]。多酚对多种细菌、真菌、酵母菌有明显的抑制作用。Singh等[3]发现肯氏蒲桃多酚对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、佛里德兰德氏杆菌、白色念珠菌显示了较好的广谱抗菌效果，抑菌直径为14.3～23.0 mm，最小抑菌浓度为0.5～2.5 mg/mL。Aziz Shahid等[4]从红花百里香中分离出酚类化合物，其中迷跌香酸对化脓性链球菌显出很好的抗菌活性。枣浆中多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度分别为(MIC)30，20 mg/mL[5-6]。这些结果表明，多酚提取物作为天然抑菌剂在食品保鲜领域具有潜在的研究和开发价值。已有研究[7-8]报道，樟树叶多酚具有优良的抗氧化活性，但其抗菌活性还未见报道。

本试验拟研究樟树叶多酚对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、黑曲霉、大肠埃希菌、荧光假单胞菌等7株常见致病菌、腐败菌的抑菌活性，以及其对草鱼肉的保鲜作用，为开发天然抗菌保鲜剂提供参考，也为樟树叶高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

樟树叶多酚提取物：本实验室自制[2,9-10];

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、青霉、毛霉：由中南林业科技大学食品科学与工程学院提供；

草鱼：2～3 kg/尾，鲜活，市售。

1.2 方法

1.2.1 多酚对试验菌株的抑菌作用 根据参考文献[11]，采用试管法测定最低抑菌浓度(MIC)，采用平皿法测定最低杀菌浓度(MBC)。

1.2.2 樟树叶多酚对草鱼片的保鲜作用 分别取5，10 g 樟树叶多酚定容至100 mL，得浓度分别为50，100 mg/mL的樟树叶多酚保鲜液。

鲜活草鱼宰杀后，去头、去尾、去内脏，清洗，切成3 cm×3 cm的鱼块，30 min内进行樟树叶多酚涂抹处理完毕，冷藏于4 ℃冰箱，使鱼肉中多酚浓度达到5，10 μL/g。

1.2.3 鱼片菌落总数测定 按GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数的测定》执行。样品的菌落计数选择营养琼脂培养基，30 ℃培养72 h。

1.2.4 鱼片pH的测定 取绞碎的草鱼鱼肉5.0 g于烧杯中，加入45 mL去CO2的蒸馏水，搅拌、浸渍30 min，过滤静置后用pH计测其上清液pH值[12]。

1.2.5 鱼片挥发性盐基氮(TVB-N)值的测定 根据文献[12]，采用半微量定氮法测定。

1.2.6 鱼片TMA值的测定 采用苦味酸法测定[12]。

1.3 数据处理

试验数据均采用3次平行试验的平均值，使用SPSS 13.0 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 樟树叶多酚最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)

本试验选取了常见食品腐败菌或致病菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、大肠埃希菌、青霉、黑曲霉、毛霉7株微生物进行研究，结果见表1。从表1可以看出，樟树叶多酚对试验菌株均有明显抑制作用，与文献[5]报道中其它植物多酚基本一致。樟树叶多酚对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉、黑曲霉、毛霉等均有明显抑制作用，抑制效果顺序为：荧光假单胞菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌=大肠埃希菌>青霉=黑曲霉=毛霉，最小抑菌浓度分别为0.500，0.625，1.250，2.500 mg/mL。荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)是草鱼冷藏过程中最主要的腐败菌[13-14]；樟树叶多酚对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度只有0.500 mg/mL，最小杀菌浓度为1.000 mg/mL；所以可以预计，樟树叶多酚可作为靶向抑菌剂用于草鱼保鲜。

2.2 樟树叶多酚对草鱼鱼片的保鲜效果

因为樟树叶多酚对草鱼冷藏过程中最主要的腐败菌[13-14]荧光假单胞菌有明显抑制作用；所以，进一步研究了樟树叶多酚对冷藏草鱼鱼片的保鲜效果。测定了樟树叶多酚对冷藏过程草鱼片中细菌总数、pH、TVB-N、TMA的影响，结果分别见图1～4。

表1樟树叶多酚的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度

Table 1 The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of camphor tree leaves’ polyphenol

mg/mL

2.2.1 对冷藏草鱼鱼片菌落总数的影响 菌落总数测定结果(图1)表明，樟树叶多酚处理明显改变了鱼片中菌落总数的变化趋势，空白样品菌落总数一直快速增加，但樟树叶多酚处理鱼肉在贮藏初期菌落总数增长缓慢，有一个明显的延滞期，5，10 mg/g樟树叶多酚添加量鱼片的延滞期分别是2，4 d；表明樟树叶多酚能有效抑制鱼肉中微生物的繁殖、生长。以鱼肉菌落总数超过6 lg CFU/g为限值[12]；空白对照鱼片菌落总数4 d即超过6 lg CFU/g；5，10 mg/g樟树叶多酚添加量鱼片分别在第6、9天超过6 lg CFU/g，所以，樟树叶多酚可延长鱼肉冷藏货架期。

图1 樟树叶多酚对冷藏草鱼菌落总数的影响Figure 1 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the colony count of Grass carp

2.2.2 对冷藏草鱼鱼片pH值的影响 由图2可知，鱼片初始pH值约6.50，空白对照鱼片pH值一直缓慢增加；樟树叶多酚处理明显改变了鱼片pH值变化趋势，贮藏初期(2 d内)，pH值有一降低的过程，此后才缓慢升高，与茶多酚保鲜的草鱼肉pH值变化趋势一致[15]。鱼肉pH值的变化与鱼体自身酶的作用及微生物繁殖有关。pH值降低是因为鱼肉中糖类酵解产生乳酸，ATP和磷酸肌酸分解产生磷酸，pH值上升主要是由于贮藏过程中微生物利用鱼肉中的蛋白质大量生长繁殖，产生TVB-N和TMA等碱性含氮物质。所以，鱼肉pH值上升，间接反映了此期间鱼肉中微生物的大量积累和繁殖。樟树叶多酚延缓了冷藏鱼肉pH值上升，间接表明樟树叶多酚对鱼体微生物的繁殖、生长有抑制作用。

图2 樟树叶多酚对冷藏草鱼片pH的影响Figure 2 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the pH of Grass carp

2.2.3 对冷藏草鱼鱼片挥发性盐基氮(TVB-N)的影响 挥发性盐基氮(TVB-N)是评价肉制品鲜度的主要卫生指标，TVB-N的增加主要是因为蛋白质在细菌的繁殖和内源性酶的作用下，分解产生的氨及胺类等碱性含氮物质；TVB-N含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，肉制品的腐败程度越严重。不同种类鱼肉的TVB-N含量可接受的上限不同[16]。周然等[17]的研究中指出鳕鱼鱼肉中TVB-N含量的可接受上限为60 mg/100 g，黑鲈的可接受上限为10 mg/100 g，鲢鱼的可接受上限为35～40 mg/100 g。杨辉等[16]在草鱼肉保鲜研究中，确定草鱼TVB-N值在17 mg/100 g以下为新鲜水平。

图3表明，在贮藏前期，鱼肉的TVB-N值增长缓慢，随着贮藏时间的延长，鱼体TVB-N值的增长速度明显高于贮藏前期，主要是因为微生物大量繁殖，氨基酸被破坏，造成挥发性含氮物质大量生成，使得鱼肉的TVB-N值急剧上升。樟树叶多酚处理明显降低了鱼肉TVB-N含量的升高速度，特别是在贮藏前期，5，10 mg/g樟树叶多酚添加量的鱼肉在冷藏开始的2，4 d，其TVB-N含量升高很少，因为樟树叶多酚处理抑制了微生物的生长繁殖，所以TVB-N增加的速度明显降低。以TVB-N含量17 mg/100 g为限量值，则5，10 mg/g 樟树叶多酚处理可使鱼片货架期从3 d分别延长至6，8 d。

2.2.4 对冷藏草鱼鱼片三甲胺(TMA)的影响 TMA有明显的鱼恶臭味，由氧化三甲胺在腐败细菌的氧化三甲胺还原酶的作用下产生。TMA也是评价鱼肉鲜度的重要卫生指标，TMA含量越高，其鲜度越差。图4表明，樟树叶多酚处理明显延缓了TMA升高的速度；对照样品从贮藏开始，TMA值即呈明显上升趋势，2 d后加速上升；樟树叶多酚处理鱼片样品在贮藏期前6 d，TMA值均只有缓慢升高。

图3 樟树叶多酚对冷藏草鱼TVB-N含量的影响Figure 3 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the TVB-N of Grass carp

图4 樟树叶多酚对冷藏草鱼片TMA的影响Figure 4 Effect of camphor tree leaves’ polyphenol on the TMA of Grass carp

3 结论

樟树叶多酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉、毛霉均有明显抑制作用；特别对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度只有0.500 mg/mL，最小杀菌浓度为1.000 mg/mL。樟树叶多酚5，10 mg/g处理可分别使冷藏鱼片货架期从3 d延长至6，8 d；樟树叶多酚可作为鱼肉靶向抑菌剂，具有进一步研究和开发价值。但樟树叶多酚的单体组成及其抑菌机制还需进一步研究。