盐酸青藤碱的抑菌与抗氧化的研究1

陈 圆，赵怡惠，黄 燕，李红伟，范红英，陈勇智

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

自20世纪70年代以来中国恶性肿瘤发病率和死亡率呈持续增长趋势.传统的手术、化疗技术会对人体造成极大的伤害，中西医结合一直是我国医疗技术的特色，中药在肿瘤的治疗上确有显著疗效，且在某些方面可弥补西医的不足，如抑制或杀伤肿瘤细胞，减轻放化疗毒副作用等［1］.因此结合中医治疗，开发新的抗肿瘤中药成为近年来研究的热点.

青风藤是防己科植物青藤（Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et wils）以及毛青藤（Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils）的干燥藤茎.青风藤早在1000多年前就被用于治疗风湿类疾病［2］，在20世纪初日本学者从青风藤中分离得到其主要成分——青藤碱［3］，青藤碱具有抗炎，免疫，镇咳，降压，抗心肌缺血的作用［4］，近年来，有学者研究发现青藤碱还具有抗氧化，戒毒［5］，多种抗肿瘤活性［6-9］.现在的临床药物有正清风痛宁片、盐酸青藤碱注射液、毛青藤总碱、青藤碱缓释剂等.青藤碱毒副作用较大，生物半衰期短，用药剂量大，且容易引起过敏性休克，白细胞减少及胃肠道反应.

本实验以盐酸青藤碱为对象，用Autoduck软件筛选出盐酸青藤碱在JAK/STAT1信号通路上可能的药物靶点，然后通过实验检测并分析药物是否对苏芸金杆菌与金葡萄球菌的有生长抑制活性和抗氧化活性.通过几种不同溶剂（乙醇、丙酮、稀碱、氯仿）提取盐酸青藤碱并检测其对二苯代苦味酰基（DPPH），2，2’-连氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）自由基清除能力及还原能力来评价其抗氧化性能，为盐酸青藤碱的药用机制研究及天然抗氧化剂开发提供科学依据.

1　材料与方法

1.1　实验材料

苏芸金杆菌、金葡萄球菌：由惠州学院微生物学实验室提供.

盐酸青藤碱：湖南正清制药集团股份有限公司提供.

1.2　实验方法

1.2.1滤纸片药液浸泡的方法

参照采用滤纸片药液浸泡的方法［10］.

1.2.2抑菌圈的测量

观察含药纸片周围有无抑菌圈，用直尺以十字交叉法测定其抑菌圈直径（包括纸片直径），一毫米为单位记录数据，实验结果用抑菌圈取平均值［11-12］.

1.2.3抗氧化活性的测定方法

参照盐酸青藤碱不同提取物的抗氧化活性的方法［13-14］.

用DPPH法和ABTS法检测以乙醇（95%）、丙酮、稀碱提取物的盐酸青藤碱的抗氧化活性.

1.2.4药物靶点筛选

运用Autoduck软件筛选出盐酸青藤碱与JAK/STAT信号通路的药物靶点.

2　结果与分析

2.1　盐酸青藤碱药物靶点筛选结果

筛选结果发现，JAK1的结合活性位点为arg879、leu881、gly882、glu883、gly884残基，盐酸青藤碱与这些位点发生对接结合，总共做了100个对接，选取其中最优十个对接构象，结合能分别为-8.46，-8.08，-7.66，-7.62，-7.56，-7.55，-7.30，-7.20，-7.18，-7.12（单位kcal/mol）.

表1　对接构象的对接活性

图1　盐酸青藤碱与JAK/STAT信号通路中JAK1蛋白的对接构象图

从以上结果可以发现：对接能量越低，表示它们的对接活性越高，抑制能力越强.从而选取最优构想的对接活性分析，显示盐酸青藤碱对JAK/STAT信号通路中JAK1蛋白具有一定的抑制能力.

2.2　盐酸青藤碱对苏芸金杆菌及金葡萄球菌的生长抑制作用

在涂有细菌的琼脂平板上，滤纸片上的待测试剂会在琼脂平板内向四周扩散，有抑菌活性，就会在纸片周围的一定距离的细菌生长会受到影响，在经过24h培养后可以形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该药物抑菌活性越大，反之亦然.按照试验方法，测得盐酸青藤碱对苏芸金杆菌和金葡萄球菌的抑菌效果（表2），可见在药物浓度为5～60mg/mL中对两种菌均有抑菌效果，且其对金葡萄球菌的抑菌效果比苏芸金杆菌好.根据药敏判断标准，抑菌圈直径在20mm以上为极敏，15～20mm为高敏，10～14mm为中敏，10mm以下为低敏，0为不敏.相对来说，盐酸青藤碱对苏芸金杆菌的抑菌圈变化不大，在8～10.33mm，为低敏；而盐酸青藤碱对金葡萄球菌的抑菌圈变化则较为明显，在8.33～13.33mm，在40～60ng/mL浓度达到中敏.

表2　不同药物浓度的抑菌效果

图2　不同浓度盐酸青藤碱对苏芸金杆菌的抑菌效果

图4　不同浓度盐酸青藤碱对金葡萄球菌的抑菌效果

2.3　盐酸青藤碱不同提取物的抗氧化活性

2.3.1不同提取物对［DPPH.］自由基清除能力的比较

在515nm处测得DPPH标准系列溶液的吸光度值，得到其线性回归方程为：

Y=0.0215x+0.007，R2=0.9989.表明在0～25μL浓度范围内DPPH浓度与吸光度呈显著正相关关系.

图4　DPPH标准曲线

按照公式计算出不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除率见图4.在0.1～0.4mg/mL浓度范围内，不同溶剂对［DPPH.］自由基清除率为：乙醇（95%）＞丙酮＞稀碱，在0.4～1.0mg/mL的浓度范围内，不同溶剂对［DPPH.］自由基的清除率为：稀碱＞丙酮＞乙醇（95%）.从图4可以看出，在0.2mg/mL浓度后，稀碱提取物的清除率上升幅度很大，清除率增幅大，说明稀碱提取物对［DPPH.］自由基清除力强，丙酮提取物则较为稳定，乙醇提取物在低浓度清除率最好，在较高浓度清除率与丙酮较接近，但都稍弱于稀碱提取物.

根据以上的相关数据，可作出相关函数，由公式算出盐酸青藤碱不同溶剂提取物的半数清除浓度和自由基清除率（表2）.结果显示半数抑制浓度和自由基清除力一致，为：稀碱＞丙酮＞乙醇（95%）.稀碱提取物的IC50最小，为0.539mg/mL，VC的IC50则为0.008mg/mL，结果显示，盐酸青藤碱的稀碱，丙酮，乙醇（95%）提取物对自由基的清除力弱于VC.

图5　不同溶剂提取物对［DPPH.］自由基的清除能力

表2　不同溶剂提取物以及VC对［DPPH.］自由基的清除效果

2.3.2不同提取物对［ABTS.］自由基清除能力的比较

在低浓度4～10μg/mL的范围内，盐酸青藤碱的乙醇（95%）提取物和丙酮提取物对［ABTS.］自由基的清除率变化不大，且丙酮提取物的清除率接近于VC的清除率，乙醇（95%）提取物的清除率在10%左右，丙酮提取物的清除率在25%上下.在10～80μg/mL的浓度梯度中，清除率变化较明显增幅加大.通过清除率的对比可见，VC以及盐酸青藤碱不同溶剂提取物对［ABTS.］自由基清除力是VC＞丙酮＞乙醇（95%）（图6）.

由此作出相关函数，由公式算出盐酸青藤碱不同溶剂提取物的半数清除浓度和自由基清除率（AE）（表3）.结果显示VC，乙醇（95%）提取物和丙酮提取物的IC50分别为：7.60μg/mL，79.89μg/mL，50.55μg/mL.VC，乙醇（95%）提取物和丙酮提取物的自由基清除率分别为：0.1316，0.0125，0.0198.结果与清除率图像一致，VC以及盐酸青藤碱不同溶剂提取物对［ABTS.］自由基清除力为：VC＞乙醇（95%）＞丙酮.

图6　不同溶剂提取物以及VC对［ABTS.］自由基清除率的比较

表3　不同溶剂提取物以及VC对［ABTS.］自由基的清除效果

3　结论与讨论

多年来对JAK-STAT1信号通路作用机制及功能已经较为清晰，天然药物化学作为细胞外的化学小分子，与细胞内的受体结合后引起受体二聚体化，从而使得与受体偶联的JAK激酶通过酪氨酸磷酸化作用而活化.活化的JAK激酶进而催化细胞因子受体的酪氨酸残基磷酸化并形成STAT1与受体复合物的结合的位点［10］，活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因相结合，进而调控靴基因的转录.

本实验采用滤纸片法检测了盐酸青藤碱的抑菌效果，表明盐酸青藤碱对苏芸金杆菌和金葡萄球菌都具有抑菌效果，且对金葡萄球菌的抑菌活性大于苏芸金杆菌.根据药敏判断标准可知，在盐酸青藤碱浓度为20～60mg/mL浓度范围内，对苏芸金杆菌为低敏；在20～30mg/mL浓度范围内，对金葡萄球菌为低敏，40～60mg/mL浓度范围内，对金葡萄球菌为中敏.

通过DPPH法和ABTS法测定了盐酸青藤碱不同溶剂提取物的抗氧化活性，结果显示盐酸青藤碱不同溶剂提取物都具有抗氧化活性.在0.1mg/mL较小浓度就开始对［DPPH.］自由基有清除能力，在0.1～0.4mg/mL浓度范围内，不同溶剂对［DPPH.］自由基清除率为：乙醇（95%）＞丙酮＞稀碱，在0.4～1.0mg/mL的浓度范围内，不同溶剂对［DPPH.］自由基的清除率为：稀碱＞丙酮＞乙醇（95%），表明在较小浓度时，乙醇对盐酸青藤碱的提取较好，在高浓度时，稀碱对盐酸青藤碱的提取较为彻底.三种提取物对［DPPH.］自由基清除力都弱于VC.由此可见盐酸青藤碱对［ABTS.］自由基具有很优秀的清除力，在1μg/mL的低浓度时，也具有一定的清除率.由于1～8μg/mL的浓度变化不大，因此清除率的变化也不大，在10～80μg/mL的浓度梯度里，清除率变化明显，且丙酮提取物在50.55μg/mL时就达到了半数清除率，且在1～4μg/mL浓度时，丙酮提取物的清除率接近于VC的清除率，但在较高浓度时弱于VC.

通过本研究的结果可以更为全面的了解盐酸青藤碱的抗氧化活性和抑菌的活性，可以作为天然抗氧化剂和抑菌剂药物的开发提供了理论基础.以其为进一步的抗肿瘤药物研究奠定坚实理论基础.