人类疱疹病毒7型和8型与扁平苔藓的相关性

管成飞　王君　史同新　王莹莹

[摘要]目的探讨人类疱疹病毒7型（HHV7）、8型（（HHV8）与扁平苔藓（LP）之间的相关性。

方法收集临床表现典型、经病理确诊的20例LP病人为实验组，切取其皮损组织；对照组为同期行美容外科手术的健康者17例，切取其皮肤组织。应用实时荧光定量PCR方法检测两组皮肤组织的HHV7 DNA和HHV8 DNA的阳性情况。

结果4例LP病人的皮损组织中检测出HHV7 DNA，对照组皮肤组织中未检测出HHV7 DNA，两组比较差异无显著性（P>0.05）。所有样本中均未检测出HHV8 DNA。

结论LP皮损组织可以检测出HHV7 DNA，但其是否参与了LP的发病机制尚不能确定。HHV8可能与LP的发病没有相关性。

[关键词]扁平苔藓；疱疹病毒7型，人；疱疹病毒8型，人；实时聚合酶链反应

[中图分类号]R758.65

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02023304

扁平苔藓（LP）是一种病因不明的炎症性疾病。其患病率为0.5%～2.0%，常见发病年龄为31～60岁，男女发病率基本相等（或者女性稍高）[1]。其病因及发病机制尚不明确，可能与自身免疫、感染、遗传、精神神经、药物、代谢和内分泌等因素有关。越来越多的研究结果表明，病毒感染可能参与了LP的发病[213]。本研究探讨LP与人类疱疹病毒7型（HHV7）、8型（HHV8）之间的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年5月—2017年7月在我科门诊就诊、临床表现典型、经病理确诊的LP病人20例，其中男9例，女11例；年龄23～62岁，平均（45.8±9.7）岁。选取同期在我院行美容外科手

术的健康者17例作为对照组，其中男8例，女9例；年龄25～58岁，平均（43.7±9.8）岁。两组性别、年龄差异无显著性（P>0.05）。

1.2HHV7 DNA和HHV8 DNA检测

1.2.1DNA提取与纯化切取LP病人皮损组织和健康对照者相同部位的皮肤组织，生理盐水清洗后电子天平称取10 mg，保存于-80 ℃待测。应用病毒DNA纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）纯化提取DNA。DNA提取液保存于-4 ℃待用。

1.2.2引物和探针的设计合成根据Genbank数据库提供的HHV7和HHV8基因序列，由大连宝生物工程有限公司设计合成引物和探针。HHV7 上游引物：5′GTCAAGCTATCCTAATG3′，下

游引物：5′ CTTGCGGTAGCACTAGA3′，探针：5′（FAM）ACrAGAATTCTCC（Eclipse）3′，总长度为189 bp。HHV8 上游引物：5′ TTTACGGACAGGGATATCAC 3′，下游引物：5′ TGGTCACAAAAGACAGCATC 3′，探针：5′（FAM）CTCCACrAGACA（Eclipse）3′，总长度为182 bp。

1.2.3标准品DNA构建利用合成基因的方法制备HHV7、HHV8片段（大连宝生物工程有限公司制作合成），通过质粒构建、阳性克隆筛选、质粒提取、质粒测序及质粒线性化得到HHV7、HHV8标准品DNA。

1.2.4标准曲线建立分别将构建的标准品DNA（1013 copies/L）用EASY Dilution按10倍梯度稀释（0、101、102、103、104、105、106倍）作为模板，应用Cycleave PCR对构建的标准品DNA进行标准曲线制作，对检测标本进行绝对定量检测。反应体系总体积为25.0 μL，内含：Cycleave PCR反应混合物12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，探针（5 μmol/L）1.0 μL，模板2.0 μL，dH2O 8.5 μL。经95 ℃预变性10 s，再按95 ℃、5 s，55 ℃、10 s，72 ℃、15 s，扩增50个循环。

1.3统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行统计学处理，数据间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

本文LP皮损组织中检测出HHV7 DNA阳性4例，阳性率为20%；对照组皮肤组织中未检测出HHV7 DNA，两组比较差异无统计学意义（P=0.109）。4例HHV7阳性标本的DNA拷贝数分别为0.79×106、2.15×106、2.47×106、3.10 ×106/L。两组样本中均未检测出HHV8 DNA。

3讨论

LP的病因及发病机制尚不清楚，多数研究认为该病是一种自身免疫性疾病。近年來，病毒感染在LP中的作用受到关注。病毒感染和LP可能主要通过免疫因素联系起来，包括T细胞免疫、体液免疫及抗病毒免疫相关分子等机制。

疱疹病毒是一类在分子生物学和医学上有重要意义的病毒，它们是典型的双链DNA病毒，在自然界中分布广泛[14]。HHV7是FRENKEL等[15]于1990年首先从健康人外周血单个核细胞中分离出的一种嗜淋巴细胞的疱疹病毒，人群感染率很高，原发感染多发生在婴幼儿期，主要引起婴幼儿急疹、玫瑰糠疹等疾病。通过检测组织中表达的HHV7抗原结构发现，此病毒主要感染CD4+T淋巴细胞、涎腺细胞[16]。HHV7主要以潜伏状态存在于CD4+T淋巴细胞中，一旦被激活，可传播至其他细胞。在涎腺细胞中，该病毒通常处于稳定的低水平持续感染状态。涎腺细胞分泌的病毒颗粒可以使机体内HHV7长期存在[17]。HHV8又名Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），是CHANG等[18]于1994年在AIDS病人Kaposi肉瘤组织中发现的一种肿瘤病毒。HHV8与多种疾病发病相关，其中已经明确HHV8是Kaposi肉瘤、原发性渗出型淋巴瘤以及多中心性Castleman病的病原体。HHV8以裂解期和潜伏期两种形式存在于B淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞等细胞内[19]。

多项研究表明，LP的发病机制主要是细胞介导的免疫反应，继发和伴随体液免疫反应。皮肤损害的最早病变首先是朗格汉斯细胞（LC）数目增多，形态及功能发生变化。LP皮损的真皮内有CD4+和CD8+两种T细胞浸润，而表皮中只有CD8+T细胞浸润。表皮和淋巴细胞之间反应可分为3个主要时期：特异性LP抗原识别、毒性淋巴细胞活化和角质形成细胞凋亡。LP抗原的性质尚不明确，可能是一种自身反应的多肽和外源性变性蛋白、化学物、药物、金属、接触过敏原、病毒、感染因子和性质未明的激发免疫应答的靶抗原。当LP抗原作用于角质形成细胞表面时，LC摄取并处理抗原后提呈给T细胞，同时激活LC分泌白细胞介素1（IL1）等细胞因子，使T细胞活化、增殖[20]。T细胞活化增殖向表皮游走，产生某些细胞因子和淋巴毒素以及自身的细胞毒性损伤基底细胞，从而引起LP的一系列病理变化[21]。

CD4分子属于免疫球蛋白超家族的成员，是相对分子质量为5.5万～6.0万的单链跨膜糖蛋白，其已被确证是HHV7感染靶细胞的重要受体[22]。HHV7感染CD4+T细胞后可导致其表面的CD4分子下调[17]。徐建[23]对HHV7侵入CD4+T细胞的分子机制研究显示，在HHV7侵入CD4+T细胞的过程中，其糖蛋白gB、gH、gL和gO介导了膜融合，且CD4分子参与了膜融合的过程，由此推测gB、gH、gL和gO中的某些糖蛋白所组成的复合物可能是CD4的配体。HHV8导致相关疾病的确切机制尚不明确。在特定的免疫缺陷状态（如器官移植或感染HIV）时机体抗HHV8的免疫反应降低，可导致HHV8感染及相关疾病。HHV8可进入树突状细胞、巨噬细胞及B淋巴细胞等，在细胞内复制并影响其功能[24]。

目前，国内外对HHV与皮肤LP的相关性研究较少。DE VRIES等[25]应用PCR检测显示，LP病人皮损样本、LP病人正常皮肤样本、银屑病皮损及健康者皮肤样本HHV7 DNA感染率分别为11/18、1/11、2/11、0/4，推测HHV7在LP皮损中繁殖，HHV7可能参与了LP的发病机制，并且在表皮和真皮的交界处周围检测到HHV7的pp85抗原，这与LP病灶的带状炎性浸润部位相一致。DE VRIES等[26]的另一项研究显示，LP病人治疗前和皮损缓解后HHV7 DNA阳性率分别为61%（11/18）和8%（1/13），且表皮和真皮中携带HHV7的细胞数量在缓解后显著降低，进一步支持HHV7参与LP发病机制。NAHIDI等[27]应用实时荧光定量PCR技术检测结果显示，HHV7可能参与了LP的发病机制。徐阳春[28]采用巢式PCR法检测显示，LP皮损组织HHV7 DNA阳性率為88.2%（30/34），与健康人皮肤组织及临床表现疑似LP而病理诊断非LP的病变皮肤组织HHV7 DNA阳性率比较，差异均有显著性。刘芳[29]研究显示，LP病人血清HHV6 DNA阳性率为5.6%（5/90），对照组为0，两组比较差异有显著性；HHV7 DNA阳性率为10%（9/90），对照组未检出，差异有显著性。

本文研究结果显示，LP组皮损组织中HHV7 DNA阳性率为20%，且阳性标本DNA拷贝数偏低，对照组未检测出HHV7 DNA，两组比较差异无显著性。推测可能的原因：①样本例数偏少， LP皮损组织和健康者皮肤组织HHV7 DNA差异性没有得到充分反映；②HHV7在人群中感染率较高，超过95%的成人HHV7血清学反应阳性[30]，本文4例HHV7 DNA阳性标本的DNA拷贝数偏低，不排除为随机感染HHV7。HHV7是否参与了LP的发病机制尚不能确定。本文所有LP病人皮损组织中均未检测出HHV8 DNA，推测HHV8可能与LP的发病没有相关性。

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（本文编辑黄建乡）