TRAIL及其受体在PCOS病人卵巢颗粒细胞表达

李科　祁秀娟　吕映频　谭慧芳　苗佳

[摘要]目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体死亡受体4（DR4）和诱骗受体1（DcR1）在多囊卵巢综合征（PCOS）病人卵巢颗粒细胞的表达及其与PCOS发病的关系。

方法收集PCOS病人30例及卵巢正常者（对照组）30例的卵巢颗粒细胞，RTPCR方法分析两组TRAIL及其受体DR4、DcR1 mRNA表达情况，Western blot法检测两组TRAIL及其受体DR4、DcR1蛋白表达情况。

结果PCOS组TRAIL mRNA及蛋白表达较对照组明显增加（t=2.641、2.891，P<0.01），DcR1 mRNA和蛋白表达较对照组明显降低（t=2.039、3.079，P<0.01），两组DR4 mRNA和蛋白表达比较差异无显著性（P>0.05）。

结论PCOS病人卵巢颗粒细胞TRAIL及其受体异常表达，可能通过参与卵巢颗粒细胞凋亡调控导致PCOS发病。

[关键词]多囊卵巢综合征；卵巢颗粒细胞；细胞凋亡；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；死亡受体4；受体，肿瘤坏死因子，成员10c

[中图分类号]R711.75

[文獻标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02019706

多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄妇女最常见的内分泌代谢紊乱性疾病，临床以卵巢多囊样改变、高雄激素血症、持续无排卵为主要临床特征，多伴胰岛素抵抗、肥胖等。其病因与发病机制复杂，随着研究的不断深入，学者们发现凋亡是参与PCOS发病的重要病理过程。PCOS病人卵巢局部特征主要表现为卵泡闭锁和持续不排卵，而凋亡是参与这些病理过程重要环节。大量研究显示，卵泡的发育、闭锁与颗粒细胞凋亡息息相关，PCOS病人卵巢颗粒细胞凋亡明显增加，多种凋亡分子参与此过程，如Fas家族及Bcl家族[12]。接受体外受精胚胎移植（IVF）的PCOS病人往往产生较多的卵母细胞，但是，这些卵母细胞和胚胎质量差，导致妊娠率低和流产率高，而这些都可能与卵巢颗粒细胞凋亡有关[3]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体是参与凋亡的重要分子，表达于卵巢及人体多种组织[4]。已有研究显示，TRAIL在PCOS模型大鼠及猪的卵巢颗粒细胞中影响卵泡发育[5]，由此可以猜测TRAIL及其受体可能参与PCOS病人颗粒细胞凋亡，进而影响卵泡发育及妊娠结局。本文比较了PCOS病人和卵巢正常妇女卵巢颗粒细胞TRAIL及其受体表达差异，初步探讨其参与PCOS发病的机制及与IVF结局的关系，为临床治疗PCOS提供实验依据。现将结果报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年8月—2017年4月就诊于我院生殖中心行IVF的PCOS病人30例，PCOS诊断符合2013年美国内分泌学会PCOS诊疗指南标准[6]。①卵巢多囊样改变（一侧或双侧卵巢2～9 mm大小的卵泡不低于12个，或卵巢体积>10 mL）；②排卵障碍：稀发排卵或无排卵；③存在雄激素分泌过多的临床症状（多毛、痤疮、脂溢性皮肤、毛孔变大、脱发等）和（或）生化指标（血睾酮≥2.46 nmol/L或游离雄激素指数>5）。符合上述标准中的2条可诊断为PCOS，且近3个月内无糖皮质激素等激素类药物服用史。排除标准：①有卵巢、子宫手术史；②合并其他导致不孕的疾病如子宫内膜异位症、高泌乳素血症等；③有其他引起肥胖的疾病或相关药物服用史者；④合并其他严重疾病者，如肝肾功能不全、癌症、精神性疾病；⑤有吸烟、饮酒等不良嗜好；⑥有食物过敏史；⑦其他引起高雄激素血症的疾病，如库欣综合征、分泌雄激素的肿瘤、先天性肾上腺皮质增生、应用外源性雄激素等。选取卵巢功能正常单纯因输卵管原因不孕的病人30例作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准，病人均知情同意。

1.2临床资料收集

收集病人的临床资料，包括年龄、体质量指数（BMI）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、孕酮（P）、雌二醇（E2）、睾酮（T）、促甲状腺激素（TSH）。检测病人注射人绒毛促性腺激素（HCG）日内膜厚度、HCG日1.4 cm以上卵泡个数、HCG日E2、Gn天数、Gn总量、优胚率、获卵数、形成胚胎数、优质胚胎数（胚胎分级按文献标准[7]）。

1.3仪器及试剂

全波长酶标仪（芬兰Thermo Scientific公司）；FTC3000 SmartQ 荧光定量PCR仪（加拿大Funglyn Biotech 公司）；percoll淋巴细胞分层液（美国Sigma公司）；Trizol试剂（KaTaRa公司）；SYBRⅡ（KaTaRa公司）；透明质酸酶（Sigma 公司）；鼠抗人GAPDH 抗体（美国 Abcam 公司）；兔抗人TRAIL、DR4、 DcR1 抗体（美国 Abcam 公司）；羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗（武汉博士德公司）。

1.4促排卵方案

根据病人基础情况采用常规长方案或拮抗剂方案促排卵。用药后根据激素水平及卵泡生长情况进

[LL]行药物调整，当2～3个卵泡直径≥18 mm时，当日傍晚注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后在阴道B超引导下行取卵手术。

1.5卵巢颗粒细胞提取

采用文献报道密度梯度离心法[8]收集卵巢颗粒细胞。取卵时收集所有大卵泡（>16 mm卵泡）液，以2 000 r/min离心10 min，沉淀物用PBS配成悬液，以1∶1的比例将细胞悬液缓慢加入体积分数0.50 Percoll分离液中，以2 500 r/min离心20 min，吸取中间白色卵巢颗粒细胞层，加入PBS洗涤2次，用红细胞裂解液洗涤、溶解红细胞，再用PBS洗涤去除红细胞裂解液，获得卵巢颗粒细胞黏液团，加入含1 g/L透明质酸酶的灭菌磷酸缓冲液1 mL，37 ℃水浴孵育10 min后，1 800 r/min离心8 min；沉淀中加入PBS 10 mL，用300目细胞筛过滤后，制成细胞悬液，调整细胞密度后-80 ℃冻存。

1.6实时荧光定量PCR检测TRAIL及其受体 DR4、 DcR1 mRNA表达

按Trizol说明书提取总mRNA，紫外线分光光度计检测RNA纯度及完整性，取吸光度（A260/A280）为1.8～2.0的样本，严格按照说明书方法，利用逆转录试剂盒（KaTaRa公司）将RNA逆转录为cDNA，置-80 ℃保存。TRAIL、DR4、DcR1引物由上海生工生物工程公司合成，见表1。按SYBRⅡ说明书进行TRAIL、DR4、DcR1 mRNA表达的检测。反应条件：95 ℃预变性30 s，40个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃变性30 s。采集荧光信号及熔解曲线进行分析，应用软件计算各样本的Ct值，应用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.7Western blot检测TRAIL及其受体 DR4、 DcR1蛋白表达

取两组卵巢颗粒细胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃离心提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；蛋白电泳转移蛋白至硝酸纤维素膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，磷酸化兔抗人TRAIL 抗体（稀释浓度1∶500）、兔抗人DR4抗体（稀释浓度1∶1 000）、磷酸化兔抗人DcR1抗体（稀释浓度1∶1 000）孵育过夜，PBST洗涤3次，相应二抗（稀释浓度1∶2 000）孵育2 h，PBST再次洗涤后显影，扫描后BioRad Quantity One软件分析灰度值，结果以待测蛋白与内参照GAPDH的灰度值比值表示。

1.8统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料比较采用卡方检验；两变量间的相关性采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组一般资料比较

PCOS组与对照组年龄、基础E2、FSH、BMI、P、TSH、Gn天数、HCG日内膜厚度、优胚率比较差异无统计学意义（P>0.05）；PCOS组基础LH、T、HCG日E2、HCG日1.4 cm以上卵泡数、获卵数、优胚数、形成胚胎数高于对照组，PCOS组Gn用量较对照组少，差异有统计学意义（t=2.186～3.982，P<0.05）。见表2。

2.2两组TRAIL及其受体mRNA表达比较

PCOS组卵巢颗粒细胞TRAIL mRNA相对表达量较对照组明显增加，DcR1 mRNA相对表达量较对照组明显减少，差异均有统计学意义（t=2.039、2.641，P<0.05）；DR4 mRNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.3两组TRAIL及其受体蛋白表达比较

PCOS组TRAIL蛋白表达量较对照组增多，DcR1蛋白表达量较对照组减少，差异有显著性（t=2.891、3.079，P<0.05）；两组DR4蛋白相对表达量比较差异无显著性（P>0.05）。见表3及图1。

2.4两组妊娠情况比较

PCOS组移植鲜胚14例，3例临床妊娠（B超见妊娠囊），妊娠率为21%；对照组移植鲜胚24例，临床妊娠13例，妊娠率为54%，两组比较差异有统计学意义（χ2=3.888，P<0.05）。进一步比较对照组鲜胚移植妊娠妇女和未妊娠妇女TRAIL mRNA表达情况，妊娠妇女TRAIL mRNA相对表达量为0.31±0.07，较未妊娠妇女（0.46±0.11）低，差异有显著性（t=3.730，P<0.05）。PCOS组冻胚移植22例，临床妊娠10例，未妊娠妇女TRAIL mRNA相对表达量为0.59±0.15，较妊娠妇女（0.39±0.12）高，差异有统计学意义（t=3.445，P<0.05）。

2.5相关性分析

PCOS组TRAIL mRNA相对表达量与获卵数、受精率、优胚数均无相关关系（P>0.05），而与优胚率呈负相关（r=-0.891，P<0.05）。PCOS组DcR1 mRNA相对表达量与获卵数、受精率、优胚数、优胚率无相关关系（P>0.05）。

3讨论

在卵泡发育的微环境中，卵巢颗粒细胞不仅能为卵母细胞提供基础营养，还能分泌有利于卵母细胞成熟的相关因子，因此，颗粒细胞在卵泡的生长过程中有重要作用。已有研究发现卵巢颗粒细胞的凋

亡影响卵泡生长、发育[9]。PCOS以排卵功能异常

（包括卵泡发育异常、无优势卵泡）、卵巢多囊样改变为主要临床特征，而这些特征均与卵泡异常闭锁有

关[10]。PCOS病人卵泡闭锁异常机制不是很明确，目前学者认为其与卵巢颗粒细胞凋亡关系密切，凋亡参与原始卵泡和初级卵泡的闭锁生理过程[11]。卵巢颗粒细胞凋亡还能造成雄激素堆积，过高浓度的雄激素进入窦状卵泡的颗粒细胞，结合

到雄激素受体，可使颗粒细胞之间的间质和多核糖小体减少，反过来造成卵巢颗粒细胞调亡的发生，如此形成恶性循环[1213]。卵巢颗粒细胞凋亡包含两条途径：线粒体途径和死亡受体途径。死亡受体途径是由死亡受体和配体结合引起的，如TRAIL及其受体、Fas及其配体FasL。线粒体途径主要由Bcl2家族相關蛋白介导[14]。有研究显示，PCOS病人卵巢颗粒细胞凋亡明显增加，P53、Fas/FasL、Bcl/Bax等凋亡因子均参与PCOS病人卵巢颗粒细胞的凋亡[1518]。

TRAIL蛋白广泛分布于人体多种组织中，如卵巢、胎盘、心脏、脾、肾、前列腺、骨骼肌等正常组织细胞中。TRAIL与其家族内成员TNFα、FasL的作用机制相似，可以选择性与其受体结合而发挥细胞毒性作用，包括诱导肿瘤细胞、病毒感染细胞或转化细胞等发生凋亡[19]。TRAIL受体主要包括死亡受体（DR4、DR5）、死亡诱骗受体（DcR1、DcR2）和骨保护素（OPG）等3类。TRAIL通过与死亡受体结合，经caspase3参与，最终诱导细胞凋亡。而与死亡诱骗受体结合则无法将凋亡信息传递至胞内，不会诱导细胞凋亡，起到保护细胞作用[2021]。因此，检测卵巢颗粒细胞表面TRAIL及其受体的表达对了解TRAIL参与PCOS发病机制具有重要意义。

本文研究結果显示，PCOS病人卵巢颗粒细胞TRAIL mRNA和蛋白相对表达量较对照组增加，推测TRAIL在PCOS的发病过程中发挥重要的作用。DcR1对细胞可发挥保护作用，本文的结果显示DcR1 mRNA及蛋白相对表达量较对照组减少，提示PCOS病人Dcr1保护作用减弱，与张娟等[22]的研究结果相一致。本文结果还显示，两组间DR4 mRNA及蛋白表达差异无显著性。推测在PCOS

病人卵泡发育过程中，TRAIL及其受体DcR1异常

表达导致凋亡过程紊乱，DcR1不能竞争性地阻止DR4/DR5与TRAIL结合，导致卵巢颗粒细胞凋亡增加，阻碍卵泡发育，最终导致无优势卵泡。另一方面，卵巢颗粒细胞凋亡异常导致卵泡闭锁异常，造成大量小卵泡的产生，从而导致卵巢多囊样改变。

凋亡除了参与卵泡发育过程，还能在妊娠过程中发挥重要作用。本文研究结果显示，PCOS组鲜胚妊娠率明显低于对照组，对照组鲜胚移植妊娠组TRAIL mRNA相对表达量较未妊娠组降低。遗憾的是PCOS组鲜胚移植的人数相对较少，未能进行TRAIL mRNA相对表达量比较。但是通过比较PCOS组冻胚移植情况显示，未妊娠妇女TRAIL mRNA表达量较妊娠妇女高，由此推测TRAIL可能通过卵巢颗粒细胞凋亡对PCOS病人妊娠产生影响。已有研究结果显示，妊娠早期不伴PCOS的复发性流产病人胎盘组织TRAIL mRNA表达及血清sTRAIL均较自愿终止妊娠女性显著增加，表明TRAIL在妊娠早期可能会增加流产的风险[23]。关于TRAIL在妊娠中的具体作用机制目前还不够清楚，有学者推测其机制可能是与子宫螺旋动脉的重建及子宫内膜异常凋亡有关，从而影响胚胎着床导致不良妊娠结局[15，24]。本文相关性分析结果显示，PCOS组的TRAIL mRNA相对表达量与优胚率呈负相关，推测可能是由于TRAIL通过诱导卵巢颗粒细胞凋亡，导致卵子发育异常，从而影响胚胎质量及妊娠结局。但其分子机制有待进一步研究。

综上所述，TRAIL及其受体DR4、DcR1均在PCOS病人卵巢颗粒细胞有表达，TRAIL及其受体DcR1的异常表达可能通过凋亡参与PCOS卵泡发育障碍及影响妊娠结局，但是具体的机制还有待研究。近期有研究显示，敲除TRAIL基因的小鼠能诱导胰岛素抵抗，推测TRAIL可能是通过调节参与葡萄糖代谢和胰岛素信号传导的基因表达来改善胰岛素敏感性[2627]。虽然这个实验没有构建PCOS模型，但是其为PCOS病人胰岛素抵抗的研究开辟了新方向。目前有研究显示，参与凋亡的TNFα和FasL通过诱导凋亡在胰岛素抵抗发病过程中扮演重要角色[2728]。所以，TRAIL能否通过诱导凋亡参

与PCOS病人胰岛素抵抗发病又是一个新的研究

方向。本实验不足之处在于样本数量不足，结果可能有一定偏差；并且由于TRAIL受体可能内化到内涵体中，单纯用Western blot技术检测受体蛋白的表达结果与实际情况可能有一定差异。

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