FAC对体外培养皮质神经干细胞分化率的影响

焦玲玲　焦倩　杜希恂　李勇　张培　姜宏

[摘要]目的探讨不同浓度柠檬酸铁铵（FAC）对体外培养的大鼠皮质神经干细胞（NSCs）细胞活力和分化率影响。

方法体外培养胚胎14～15 d的皮质NSCs；应用CCK8细胞增殖和毒性检测试剂盒检测经FAC处理后NSCs细胞活力的改变，免疫荧光染色检测Nestin、βtubulin Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞，Western Blot检测NSCs的βtubulin Ⅲ和GFAP蛋白表达水平。

结果分离培养的皮质NSCs能增殖形成神经球，且经分化培养基诱导后可分化为βtubulin Ⅲ或GFAP阳性的细胞。不同浓度（10～100 mg/L）的FAC均可降低细胞活力（F=55.86，q=9.154～15.880，P<0.01）。不同浓度的FAC不影响NSCs的βtubulin Ⅲ和GFAP蛋白表达水平（P>0.05）。

结论FAC可降低皮质NSCs细胞活力，但不影响NSCs向神经元和星形胶质细胞的分化比例。

[关键词]神经干细胞；铁；细胞活力；细胞分化

[中图分类号]R329.2

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02017205

神经干细胞（NSCs）是存在于胚胎脑部和成熟个体中枢神经系统中具有增殖和多向分化潜能的一类细胞，可通过对称性分裂进行增殖和自我更新，通过不对称性分裂分化成为神经元或胶质细胞等[14]。因其具有增殖和多向分化潜能，NSCs移植可弥补丢失的神经元，成为神经系统疾病细胞替代治疗的可行性方案之一[58]。但移植入体内的NSCs的存活、凋亡、增殖和分化受到宿主机体内微环境的影响，因此研究影响NSCs存活和分化的因素对干细胞移植治疗至关重要[910]。越来越多的研究显示了金属铁与神经退行性疾病有密切联系，如帕金森病（PD）和阿尔兹海默病（AD）等[1113]。近年来研究表明，PD病人黑质致密带的铁含量升高明显，水平异常升高的铁可能通过促进活性氧（ROS）的生成，损伤多巴胺（DA）能神经元[1415]。有研究显示，AD病人脑内的海马和皮质区铁沉积明显增加[16]。有文献报道，给予高铁饮食的新生小鼠纹状体内铁明显增多，且腦干和纹状体内羟自由基水平增高[17]。因此，移植于脑内的NSCs的存活和分化可能受到高铁微环境的影响。然而，高铁环境对NSCs分化率的影响尚未见报道。柠檬酸铁铵（FAC）是一种广泛应用于制备铁负载模型的三价铁[1819]，可造成细胞内的高铁状态。本文通过体外培养皮质NSCs，外源性给予FAC的方法，观察不同浓度的FAC对皮质NSCs细胞活力和分化率的影响。

1材料和方法

1.1实验材料

Wistar大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），FAC（Sigma公司），DMEM/F12培养液（Hyclone公司），表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、N2 supplement、B27 supplement和胎牛血清（Gibco公司），兔源βactin抗体（CST公司），小鼠源βtubulin Ⅲ抗体、山羊抗鼠IgG荧光二抗（Invitrogen公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗（Absin公司），4，6二氨基2苯基吲哚（DAPI）细胞核染色液（Roche公司）。

1.2皮质NSCs的培养和鉴定

取孕14～15 d大鼠胚胎大脑皮质部位组织，机械剪碎和吹打后过滤离心，细胞计数后种植在培养瓶中，置于温度37 ℃、含体积分数0.05 CO2的无菌孵箱中培养，使用含有DMEM/F12、体积分数0.02的B27 supplement、体积分数0.01的N2 supplement、10 μg/L的bFGF、20 μg/L的EGF、10 g/L青霉素和链霉素混合液的完全培养液进行培养。NSCs培养4～5 d时进行传代，传至第3代时，将100 μL的NSCs种植于多聚赖氨酸包被的玻片上，密度为（1～2）×108/L，使用含体积分数0.01胎牛血清的分化培养液进行诱导分化，分化7 d后用预冷的40 g/L多聚甲醛固定NSCs，免疫荧光染色后观察细胞分化情况。

1.3免疫荧光染色

NSCs经固定后封闭，加入小鼠源单克隆抗体（βtubulin Ⅲ、GFAP、Nestin），于4 ℃孵育过夜；洗脱后加山羊抗鼠IgG荧光二抗（1∶500）室温孵育1～2 h，加入DAPI室温染色5～15 min后洗脱并封片，荧光显微镜下观察、拍照。

1.4细胞活力检测

将第3代的皮质NSCs传代种植于96孔板，每孔100 μL，种植密度为（1～2）×108/L，置于培养箱中培养24 h后加入不同浓度（0、10、50和100 mg/L）的FAC，继续培养24 h。在测定前的2～4 h，每孔加入10 μL的CCK8溶液，然后将96孔板置于POLARstar+OPTIMA微板测试仪上检测，检测波长为450 nm。以吸光度值为纵轴、时间为横轴计算细胞活力的变化。

1.5Western Blot检测

种植于6孔板的细胞加裂解液提取蛋白质，采用BCA法测蛋白浓度。按每孔20 μg蛋白上样，蛋白经SDSPAGE电泳后电转移到PVDF膜上，于室温下用100 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，加入相应一抗（兔源βactin抗体及小鼠源βtubulinⅢ、GFAP抗体），于4 ℃孵育过夜，洗脱后用1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，ECL发光液显影，UPV凝胶成像系统成像后用Image J软件读取条带的灰度值。

1.6统计学方法

应用SPSS和GraphPad Prism软件进行统计学分析，结果以[AKx-D]±s表示，组间比较采用Oneway ANOVA检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1NSCs的培养和鉴定

在皮质NSCs培养5 d时可增殖成直径200～300 μm的神经球。免疫荧光染色显示，神经球细胞Nestin阳性，说明皮质NSCs能保持神经干细胞的增殖特性（图1A）；皮质NSCs经诱导分化7 d后，可见βtubulin Ⅲ阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞（图1B），说明皮质NSCs具有多向分化潜能，可向神经元或星形胶质细胞分化。

2.2FAC对NSCs细胞活力的影响

NSCs经10、50和100 mg/L的FAC处理后继续培养24 h，检测细胞活力分别为0.133±0.009、0.087±0.006、0.086±0.008。与不给予FAC处理的对照组（0.198±0.024）相比，10、50和100 mg/L FAC处理组NSCs细胞活力均显著降低（n=4，F=55.86，q=9.154～15.880，P<0.01）；与10 mg/L FAC处理组相比较，50和100 mg/L FAC处理组NSCs细胞活力均显著下调（q=6.537、6.729，P<0.01）；50和100 mg/L FAC处理组间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3FAC对NSCs分化率的影响

Western Blot检测显示，与不给予FAC处理的对照组相比较，10、50和100 mg/L FAC处理组的βtubulin Ⅲ和GFAP蛋白表达水平均无显著变化（n=3，P>0.05）。见图2。

3讨论

NSCs是脑内具有增殖分裂和多向分化潜能的神经母细胞。本研究应用免疫荧光染色法证实，体外培养的大鼠胚胎皮质NSCs可增殖形成神经球，且随着培养时间的延长，细胞数量增多，体积变大，培养至第5天时，神经球细胞呈Nestin阳性，证明培养的干细胞具备NSCs增殖分裂的特性。NSCs还可向多种神经细胞分化，如分化为神经元（DA能、胆碱能、GABA能）、星形胶质细胞及少突胶质细胞等。本文研究结果显示，皮质NSCs经诱导分化7 d后，可以出现GFAP阳性的星形胶质细胞和βtubulin Ⅲ阳性的神经元，进一步证实NSCs的多向分化潜能。NSCs的分化可以受到多種因素的调控，除了受内在基因的调控，更受到周围复杂微环境的影响[2021]。

铁是人体必需的微量元素，是许多生物大分子的重要组成部分，参与了生命的基本活动，在脑内还参与了神经递质和髓鞘的合成[2225]。PD病人黑质总铁含量较同年龄的健康人高70%左右，铁水平增高可促进H2O2生成羟自由基[20]。本文研究结果显示，10～100 mg/L的FAC可降低皮质NSCs细胞活力，进一步证实了过量的铁对细胞的毒性作用。氧化应激增强、自由基生成增多均可造成氧化损伤，并能引起细胞死亡[2627]。有研究表明，胞内高铁可通过芬顿反应产生过量的ROS，从而诱导细胞凋亡[18，28]。近年来发现的铁死亡是一种细胞内氧化还原平衡被打乱并形成铁离子依赖的氧化性死亡方式，铁聚集和铁依赖的脂质形成及胞质ROS生成是铁死亡的重要因素[13，18，2930]，但目前还没有文献报

道铁死亡是否参与了NSCs的死亡。有研究显示， FAC可能通过芬顿反应产生的ROS促进破骨细胞的分化[31]。然而，也有研究表明，FAC对软骨细胞的分化起到抑制作用[32]。本研究观察到，FAC不影响体外培养皮质NSCs向神经元或星形胶质细胞的分化比例，可能FAC对不同细胞分化的影响具有特异性，其机制还需要进一步的研究。

综上所述，FAC可降低皮质NSCs的存活能力，进而影响神经再生，但对皮质NSCs的分化无显著影响。

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