HPLC法同时测定油茶籽油中的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯

林树真，龙婷，段明慧，史庆龙，葛发欢，周丹

（1.广州市金妮宝食用油有限公司，广东广州 511475）（2.中山大学南沙研究院，广东广州 511458）（3.中山大学药学院，广东广州 510006）

油茶籽油是从山茶科油茶树的种子中获得，是我国最古老的木本食用植物油之一。中国是世界上山茶科植物分布最广的国家，也是茶油最大的生产基地，此外东南亚、日本等国家有极少量的分布[1]。油茶籽油具有预防各种心脑血管疾病、延缓动脉粥样硬化降血脂、降血压等功效[2～4]，是一种优质的保健食用油。经报道，油茶籽油的不饱和脂肪酸均高于橄榄油，理化特性与其也极为相似，从而被誉为“东方橄榄油”[5～7]。目前，油茶籽油被联合国粮农组织列为健康型高级食用植物油重点推广，深受广大消费者的青睐[8]。随着现代社会的发展和人民生活水平的提高，消费者对生活的品质的要求越来越高，对日常所需的食用油脂的安全与品质更加关注，要求也更为严格，因而优质的食用油逐渐成为现代生活的必需品。

食用植物油均由皂化物和不皂化物两大部分组成，皂化物部分占99%左右，主要包括三酰甘油和游离脂肪酸，其中三酰甘油的脂肪酸主要由饱和脂肪酸和不饱和脂肪脂肪酸组成[9]。不皂化物占1%左右，包括游离醇、三萜烯、生育酚、维生素、甾醇和角鲨烯等成分。这些有益于人体健康的活性成分是评价植物油质量的重要指标。

目前，国内外油茶籽油的成分研究主要集中在脂肪酸的种类[10～12]，对不皂化物类的活性成分研究相对缺乏。任传义等对油茶籽油等植物油中的主要化学成分进行了分析[13]，通过气相色谱法对角鲨烯和β-谷甾醇进行了含量测定，液相色谱法对维生素E的含量的进行测定，但是针对油脂样品的气相检测和液相检测，必须分别制样，过程繁琐，方法复杂。

张东生、钟冬莲等[14,15]通过气相色谱法等对油茶籽油中的角鲨烯进行了定量分析，成分分析单一。关于用液相方法同时测定油茶籽油中多种营养成分的文献尚未见报道，本文建立了一种高效液相检测方法，对油茶籽油中的生育酚、甾醇和角鲨烯的含量同时进行测定，并对方法的可靠性进行了全面的考察，为油脂的品质分析提拱了有效的途径，对于更好的开发和推广油茶籽油资源和产业发展具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 原料

油茶籽油来源于实验室超临界设备萃取；γ-生育酚标准品（阿拉丁，纯度96%），β-谷甾醇标准品（阿拉丁，纯度＞95%），角鲨烯标准品（阿拉丁，纯度＞95%）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司），二氯甲烷、甲酸（分析纯，广州化工厂），超纯水自制。

1.2 仪器设备

实验仪器：美国戴安高效液相色谱仪 UltiMate 3000（包括梯度泵SR-3000、自动进样器WPS-3000、柱恒温系统TCC-3000、检测器DAD-3000、色谱工作站变色龙7.2）；色谱柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。XS205 Dual Range型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；KQ-500E超声波处理器(昆山超声设备有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 HPLC色谱条件的建立

选用三种不同色谱柱：Phenomenon Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，考察对样品的分离效果；在不同的波长（205 nm、210 nm、283 nm、300 nm）条件对比分析，选择最佳波长。样品流动相：100%甲醇；流速：0.7 mL/min；柱温：30 ℃；等度洗脱。

1.3.2 对照品溶液的配制

称取10.0 mg的γ-生育酚，加甲醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成浓度为1.00 mg/mL的γ-生育酚标准品储备液；称取10.9 mg的β-谷甾醇，加甲醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成浓度为1.09 mg/mL的β-谷甾醇标准品储备液；称取13.9 mg的角鲨烯标准品于10 mL的容量瓶中，加入甲醇/二氯甲烷（V/V=1:1）溶液定容至刻度线，配制成浓度为1.39 mg/mL的角鲨烯标准品储备液。

1.3.3 供试品的制备

称取5 g左右的供试品于250 mL的容量瓶中，加入50 mL的1 mol/L的氢氧化钾的乙醇溶液。于90 ℃的水浴锅中回流 2 h。停止加热，从回流管顶部加入50 mL水并旋转摇动。

冷却后转移皂化液到250 mL分液漏斗中，加入50 mL正己烷，盖好旋塞，用力摇1 min，倒转分液漏斗，并小心打开旋塞，间歇地释放内压，静置分液漏斗，至溶液分层后（如果形成乳液，须加入少量乙醇溶液破乳）。

将下层皂化液放入第二只分液漏斗中。用相同的方法，每次用50 mL正己烷对皂化液萃取两次。将三次收集的正己烷置于同一分液漏斗中。

用10%的乙醇水溶液，洗涤上述提取液，每次用量25 mL，并剧烈摇动，洗涤后弃去乙醇水溶液，每次弃去洗涤液后，保持分液漏斗中剩余2 mL洗涤液，然后将分液漏斗沿其轴成线旋转，静置数分钟，使剩余的乙醇水相进一步分离，然后弃去。继续用乙醇水溶液洗涤，直到洗涤液加入1滴酚酞后不呈现粉红色为止。

通过分液漏斗的上口小心地将正己烷溶液转移到至圆底烧瓶中，在 50 ℃条件下，于旋转蒸发仪中除掉溶剂。将烧瓶中的残留物转移至5 mL的容量中，加入甲醇/二氯甲烷（V/V=1:1）溶液定容至刻度线，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，进液相。

2 结果与分析

2.1 色谱条件建立

通过对Phenomenon Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱子的考察和不同波长的紫外吸收考察，最终确定的HPLC色谱条件为：色谱柱：Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：100%甲醇；流速：0.7 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：205 nm；等度洗脱。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of the camellia oil

在确定的色谱条件下，通过测定“1.3.2”中的标准品的色谱图，与样品进行一一核对，对油茶籽油样品中的相关组分进行了定性分析。结果如图1所示定性出的三种营养成分为：γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯。

2.2 标准曲线的绘制

分别取适量的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯对照品，稀释到不同的浓度，在“1.3.1”条件下，进行液相分析。以峰面积为纵坐标，标准品的质量为横坐标，绘制如下的标准曲线。γ-生育酚回归方程为：y=237.89x-0.052，R2=1；β-谷甾醇的回归方程为：y=5.32x-0.0053，R2=0.9999；角鲨烯的回归方程分别为：y=80.15x-0.528，R2=0.9990。结果表明，γ-生育酚在 0.01～0.40 μg，β-谷甾醇在 0.44～10.94 μg，角鲨烯在0.01～0.55 μg 呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

取γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯对照品溶液，各连续进样6次，以对照品的峰面积计算精密度。结果如表 1所示，γ-生育酚的 RSD=0.19%，β-谷甾醇的RSD=0.47%，角鲨烯的RSD=0.86%。上述结果均符合试验要求。

表1 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯精密度试验结果Table 1 Precision of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

2.4 稳定性试验

表2 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯稳定性试验结果Table 2 Stability of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

取同一批次样品，样品按照“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件，于 0、2、4、6、8 h分别测定，以γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯的含量来考察稳定性，结果如表2，γ-生育酚的RSD=1.92%，β-谷甾醇的RSD=1.72%，角鲨烯的RSD=1.88%。上述结果均符合试验要求。

2.5 重复性试验

取同一批号的样品，平均制备6份，按照“1.3.3”项的方法制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL，连续进样，以γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯的含量来考察重复性。γ-生育酚的 RSD=0.86%，β-谷甾醇的RSD=1.48%，角鲨烯的RSD=1.32%。上述结果均符合试验要求。

2.6 加样回收率试验

精密称取已测含量的同一批样品，按照“1.3.3”项的方法制备样品，精密移取一定体积的上述溶液，加入适量的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯的标准品溶液，测定其含量，并计算回收率。结果如表4、表5和表6所示，γ-生育酚的 RSD=1.28%，β-谷甾醇的RSD=1.54%，角鲨烯的RSD=1.58%。上述结果均符合试验要求。

表3 γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯重复性试验结果Table 3 Repeatability of γ-antisterility vitamin, β-sitosterol and squalene

表4 γ-生育酚加样回收率试验结果Table 4 Average recoveries of γ-antisterility vitamin

表5 β-谷甾醇加样回收率试验结果Table 5 Average recoveries of β-sitosterol

表6 角鲨烯加样回收率试验结果Table 6 Average recoveries of squalene

2.7 样品含量测定

取同一条件下制备的不同批次的超临界萃取的油茶籽油，按照“1.3.3”项下的方法制备供试品溶液，检测样品中γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯的含量。油茶籽油液相色谱图如图1所示，检测结果如表7所示，表明三批样品的测定结果重复性较好。

表7 油茶籽油样品中营养成分的含量(mg/100g)Table 7 Determination of nutrient content in camellia oil samples

3 结论

本研究开发了一种高效、快速检测油茶籽油中的γ-生育酚、β-谷甾醇和角鲨烯的方法。通过对该方法线性度、重复性、稳定性和加样回收率的考察，结果表明该方法有效可信，可以用于油茶籽油的品质控制，对油茶籽油的推广应用具有重要意义。在该方法下，对本实验室超临界提取的同一条件下，不同批次的油茶籽油进行了相关分析，重复性较好。