黄豆酱油与黑豆酱油抗氧化活性及风味物质的比较

张欢欢，耿予欢，李国基

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

以大豆为原料制成传统发酵豆制品，如酱油、腐乳、豆豉和豆酱等食品，起源于中国，距今已有两千多年的历史。其香气浓郁，滋味鲜美，营养价值丰富，且易消化吸收，并具备一定的保健作用。据《本草纲目》载：“大豆有黑、白、黄、褐、青、斑数色，黑者入药”[1]。黄豆、黑豆同属大豆类，营养价值大同小异，其中黑豆有药用价值。黄豆、黑豆都含有丰富的蛋白质、微量元素、B族维生素和异黄酮类物质。黑豆种皮含原花青素及花色苷类物质，有研究表明黑豆蛋白质[2]、维生素、总酚及总花色苷比黄豆高[3]，故而黑豆营养成分及抗氧化活性更高。

原料是构成酱油成分的物质基础，滋味好、风味佳的酱油的酿造需要好品质的原料。目前，生产上普遍以黄豆或黄豆粕为主要蛋白原料来酿造高盐稀态酱油[4]。关于黄豆、黑豆发酵制品的对比目前多集中在豆豉类产品，候竹美[5]等用米曲霉发酵黄豆和黑豆制备豆豉，发现黑豆豉抗氧化活性比黄豆豉高。而酱油类产品及其功能成分、抗氧化活性、挥发性风味物质的对比尚少见，梁姚顺[6]等以黑豆酿造酱油，发现黑豆酱油品质、风味可与黄豆酱油媲美，营养价值更胜黄豆酱油一筹。在满足营养、风味口感前提下，功能性越佳的食品更易受到人们的追捧。因此，利用黑豆的营养价值、功能价值来提高酱油的整体质量，可为高品质、高抗氧化活性酱油的制备提供优质资源及新思路。

本研究采用高盐稀态酱油酿造方法，以黄豆、黑豆为蛋白原料来分别制备黄豆酱油、黑豆酱油，比较两种酱油基本营养成分、活性物质及抗氧化活性，并对比分析其挥发性风味物质的差异。同时为探索黑豆酱油理化特性提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆（38.52%蛋白质含量、28.77%淀粉含量）、黑豆（42.53%蛋白质含量、30.05%淀粉含量）、面粉（15.54%蛋白质含量、72.82%淀粉含量）、米曲霉（沪酿3.042），均由李锦记（新会）食品有限公司提供。

奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox），阿拉丁公司；2,2’氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH），阿拉丁公司；2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS），阿拉丁公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），Sigma公司；荧光素钠（FL），阿拉丁公司；18种氨基酸标准品，Sigma公司；福林酚，国药集团；没食子酸、芦丁，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FE-20 pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；KDN-102F定氮仪，上海纤检仪器有限公司；IKA旋涡混合器、PAL-αBrix计，日本ATAGO公司；UV-2100紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；A300全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司；SpectraMax M2多功能酶标仪，美国Molecular公司；固相微萃取头（75 μm CAR/PDMS），美国色谱科技公司；DSQⅡ气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司；三合一自动进样器，澳大利亚SGE公司。

1.3 方法

1.3.1 酱油的工艺流程及制作方法

精选的大豆（黄豆和黑豆）→浸泡→蒸料→冷却→加辅料面粉→接种米曲霉制曲→翻曲→成曲→制醅发酵→滤油→头抽

按照黄豆/黑豆:面粉=7:3（m/m）的配比将原料混合均匀，置于压力为1.0～1.5 kg/cm2蒸球中保压10～15 min，控制熟料水分在48wt%～53wt%，冷却至35 ℃以下，按4‰比例接种沪酿3.042米曲霉。通风制曲，时间控制在36～48 h，温度控制在30～35 ℃。制曲结束后，按添加量为成曲的2.3倍左右添加盐水，采用高盐稀态酱油发酵方法酿造，常温发酵150 d，过滤得头油。每个样品平行发酵3缸。

1.3.2 基本理化指标分析

中性蛋白酶活根据SB/T 10317-1999测定，采用福林酚法。淀粉酶活根据GB 8276-2016测定，采用还原糖法。氨基态氮根据GB/T 5009.235-2016测定，采用甲醛滴定法。总氮根据GB 18186-2000测定，采用凯氏定氮法。还原糖根据GB/T 5009.7-2016测定，采用直接滴定法。总酸根据GB/T 12456-2008测定，采用酸碱滴定法。氯化钠根据GB 18186-2000测定，采用直接滴定法。固形物用Brix计测定。

1.3.3 游离氨基酸的测定

游离氨基酸样品前处理使用磺基水杨酸法。

4 mL样品与1 mL 15%的磺基水杨酸溶液混合沉淀样品中大分子的蛋白和多肽，4 ℃下反应1 h，4 ℃10000 r/min离心15 min。过滤，样品经过微滤膜（0.22 μmol）处理。用液相离子交换柱（分离柱 TS263，membra Pure）分离氨基酸，茚三酮显色，流速为60 μL/min，除脯氨酸检测波长为440 nm，其余均在570 nm处检测。各氨基酸浓度采用外标计算。

1.3.4 总酚、总黄酮含量测定

样品经滤纸过滤，稀释成一定浓度。总酚的定量参考Xu和Chang[7]的方法，略有修改。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.116x-0.003(R²=0.999)；酱油总黄酮的定量参考Dewanto等[8]的方法，略有修改。以芦丁为标准品，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.811x+0.006（R²=0.999）。

1.3.5 美拉德中间产物及后期产物[9]

样品经滤纸过滤，稀释成一定浓度，采用紫外可见分光光度计分别测定稀释液在294 nm和420 nm处吸光值，以A294nm表征美拉德中间产物及以A420nm表征美拉德末期产物类黑精。

1.3.6 酱油抗氧化活性测定

样品经滤纸过滤，稀释成一定浓度，DPPH自由基清除能力参考李莹[10]的方法测定；ABTS自由基清除能力参考李莹[10]的方法有所改进；还原力测定参考李丹[11]的方法；OARC值根据曹亚兰[12]的方法有所改进。

1.3.7 酱油风味物质的测定

1.3.7.1 挥发性化合物的萃取

参考蔡宇[13]的方法萃取挥发性成分。样品的准备和固相微萃取的方法如下：8 mL酱油装进20 mL气质瓶中并加入1 g氯化钠使其盐浓度达到饱和，加20 μL的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液（1.724 mg/L）作为内标。在45 ℃下保温20 min后，酱油样品采用CAR/PDMS萃取头在45 ℃下萃取40 min，待萃取结束后，萃取头插入进样口解析3 min。

1.3.7.2 GC-MS条件[14]

色谱柱：TR-5 ms弹性石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 µm)；升温程序：40 ℃作为起始温度，以5 ℃/min升至120 ℃，再以7 ℃/min升至220 ℃，保持5 min；载气(He)流速1.0 mL/min；分流比：10:1。

质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；电子倍增器电压350 V；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z35～350；扫描速度3.00 scans/s。

1.3.8 统计分析

用Origin 9.0软件对数据进行处理和图表的绘制，数据代表平均值±标准差。用 SPSS 19.0软件进行ANOVA差异性分析及相关性分析，同列不同小写字母表示同一列数据差异显著(p＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 黄豆酱油和黑豆酱油成曲蛋白酶活、淀粉酶活的比较

表1 成曲中性蛋白酶活及淀粉酶活Table 1 Protease activity and amylase activity of soybean koji

由表1可知，相同制曲条件下，黑豆成曲中性蛋白酶活、淀粉酶活均比黄豆成曲高。已知黑豆蛋白质含量为42.53%、淀粉含量为30.05%，黄豆蛋白质含量为38.52%、淀粉含量为28.77%，黑豆原料较黄豆原料能提供更高的蛋白质、淀粉含量，而相同制曲条件下，提供的底物碳源、氮源越多，米曲霉生长越旺盛，酶活相对较高[15]。酱油酿造中蛋白酶、淀粉酶起主要作用，酶活高低直接影响原料转化利用率、发酵速率等。依据黑豆成曲酶活高，其原料转化利用率较黄豆高。

2.2 黄豆酱油和黑豆酱油基本成分比较

图1 两种酱油氨基酸含量的比较Fig.1 Comparison of amino acids content in two kinds of soy sauces

如表2所示，黑豆酱油氨基态氮、总氮、还原糖、总酸及固形物含量均显著高于黄豆酱油（p＜0.05），氯化钠含量无显著性差异。黄豆酱油、黑豆酱油氨基态氮和总氮分别为0.91 g/100 mL、1.07 g/100 mL；1.41 g/100 mL、1.56 g/100 mL，其中氨基态氮含量均高于特级酱油标准（0.80 g/100 mL），说明原料蛋白质含量越多，蛋白酶活越高，最终酱油含可溶性含氮化合物越多，这与王猛[16]研究结果一致。黑豆酱油还原糖达5.55 g/100 mL，显著高于黄豆酱油还原糖2.10 g/100mL（p＜0.05），部分原因是由于黑豆淀粉含量高、黑豆成曲淀粉酶活高，即酶作用底物多、酶活高，故黑豆酱油含还原糖多，可推断黑豆酱油甜味口感比黄豆酱油重。还原糖经微生物代谢逐渐转化为有机酸，伴随美拉德反应缓慢进行，pH下降，总酸上升，其中黄豆酱油总酸较低，应是其有机酸类物质缓慢转化为醇、醛和酯类等物质的速度超过酸的积累速度[17]。

两种酱油18种氨基酸含量如图1所示，黄豆酱油、黑豆酱油氨基酸总量分别为 48.75 mg/mL、45.91 mg/mL。依Kato[18]和Schoenberger[19]对氨基酸呈味描述及分类可知，酱油中呈味氨基酸可分为鲜味、甜味、苦味及无味氨基酸。研究表明酱油的鲜味主要由鲜味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸和一些甜味氨基酸贡献。如图 1所示，黄豆酱油鲜味氨基酸总量（9.37%）显著高于黑豆酱油（5.66%）。甜味氨基酸包括丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苏氨酸及丙氨酸，两种酱油总量无显著性差异（p＞0.05）。因此黄豆酱油鲜味相对更重。苦味氨基酸有8种，分别占总氨基酸含量43.04%（黄豆酱油）及41.89%（黑豆酱油），虽然其含量远高于鲜味、甜味氨基酸，但苦味呈味效果受氯化钠、糖、酸的抑制[20,21]及酱油中鲜味肽、鲜味协同物质影响[22,23]，两种酱油主导滋味是鲜味、咸味。

表2 两种酱油基本营养成分的比较Table 2 Comparison of basic nutritional content in two kinds of soy sauces

2.3 发酵过程中黄豆酱油、黑豆酱油总多酚和美拉德产物的变化

图2 发酵过程中两种酱油总酚与总黄酮（a）、美拉德产物（b）的变化Fig.2 Changes of total phenolics, total flavonoids(a) and Maillard products (b) in two kinds of soy sauces during fermentation

多酚类化合物由于酚羟基的作用，具有较强的抗氧化能力以及清除自由基的能力，是高效天然抗氧化剂[24,25]，主要包括酚酸、黄酮和单宁类物质等[26]。Xu[3]和Takahashi[27]等研究表明，黑豆和黄豆中含有大量的多酚类化合物，并具有较高的抗氧化能力。如图2（a）所示，黑豆酱油总酚、总黄酮随发酵时间的增长呈持续上升的趋势，黄豆酱油呈先上升后平缓的趋势。发酵150 d，黑豆酱油总酚、总黄酮含量显著高于黄豆酱油（p＜0.05），其中黑豆酱油总酚达550.75 mg/dL，为黄豆酱油的1.6倍；黑豆酱油总黄酮达57.32 mg/dL，为黄豆酱油的1.5倍。应是黑豆原料总酚、总黄酮含量比黄豆高，或是黑豆淀粉酶活高有利于原料中多酚类物质的释放[28]。由于酱油中酪氨酸含酚羟基，福林酚法测得的酱油总酚含量稍有偏高。

美拉德反应能赋予酱油独特的风味和色泽，有研究表明美拉德后期产物类黑精等美拉德产物是酱油抗氧化物质重要组分[9]。分别以294 nm和420 nm处吸光值表征美拉德反应中间产物和后期产物的生成量，探究美拉德反应产物变化规律。如图2（b）所示，294 nm和420 nm吸光值随发酵时间延长明显增加，说明美拉德中间产物不断形成，并进一步生产美拉德后期阶段产物。整个发酵过程，黑豆酱油 A294nm、A420nm值均比黄豆酱油低，说明黑豆酱油中大量积累的还原糖及氨基化合物转化为美拉德产物效率比黄豆酱油低。

2.4 黄豆酱油和黑豆酱油发酵过程中抗氧化活性的比较及相关性分析

采用DPPH法、还原力、ABTS及ORAC法来评价酱油的抗氧化活性，发现酱油的抗氧化活性随发酵时间延长显著上升（p＜0.05），主要是因为原料中酚类、多肽类等活性物质不断溶出，美拉德产物、呋喃酮等活性物质也不断生成[29]。如图3所示，发酵前期（30 d）黄豆酱油抗氧化活性显著高于黑豆酱油，应是发酵前期黄豆酱油总酚含量及美拉德产物含量更高（p＜0.05）。发酵60 d，黑豆酱油抗氧化活性已赶超黄豆酱油，其还原力、TEAC及ORAC值随发酵时间延长显著高于黄豆酱油（p＜0.05），清除DPPH自由基能力两者相差不大，并无显著性差异。总体来看，发酵完全的黑豆酱油抗氧化活性比黄豆酱油强。

图3 发酵过程中两种酱油DPPH清除率（a）、还原力（b）、TEAC值（c）、ORAC值（d）的比较Fig.3 Comparison of DPPH scavenging capacity (a), reducing power (b), TEAC value (c) and ORAC value (d) in two kinds of soy sauces during fermentation

表3 成品酱油活性物质与抗氧化活性之间的相关性Table 3 Correlation among the active components in soy sauce and their antioxidant activity

酱油具有一定的抗氧化性，主要来源于蛋白质降解产生的小分子活性肽、类黑精、酚类物质及呋喃酮类物质等[29]，因此选取总酚、总黄酮及美拉德产物作为酱油抗氧化活性成分进行分析。

对两种成品酱油活性物质与抗氧化活性进行相关性分析，结果如表3所示，还原力、TEAC及ORAC值分别与总酚、总黄酮含量呈极显著性正相关（p＜0.01，r＞0.8），因此可推断总酚、总黄酮是赋予酱油抗氧化能力的重要因子。还原力、TEAC、ORAC值与类黑精呈极显著性负相关（p＜0.01，r＜-0.9），而DPPH清除率与类黑精存在一定正相关性（r=0.757），说明类黑精也是影响酱油抗氧化能力的因子，因此需采取多种抗氧化方法来评价，而不能通过单一的抗氧化方法来评价酱油的抗氧化活性。这主要因为不同抗氧化评价方法的原理不同，不同的抗氧化活性物质对不同的抗氧化能力评价方法的响应因而不同[30]。

2.5 黄豆酱油与黑豆酱油风味物质的比较

表4 两种酱油主要挥发性成分的比较Table 4 Comparison of main volatile components in two kinds of soy sauces

40 4.07 乙醛 25.1 -41 5.22 2-甲基-丙醛 5.3 27.7 42 7.1 3-甲基-丁醛 33.6 -43 7.37 2-甲基-丁醛 25.1 148.3 44 10.11 2-甲基-2-丁烯醛 2.3 15.1醛类 45 11.82 3-甲基-2-丁烯醛 - 2.4 46 16.99 庚醛 - 1.9 47 17.21 3-甲硫基丙醛 16.3 57.4 48 19.72 苯甲醛 39.1 80.5 49 23.28 苯乙醛 103.2 100.9 51 24.87 4-甲基-苯甲醛 - 26.8 51 25.64 壬醛 - 3.1 52 30.46 2,4-二甲基-苯甲醛 5.5 -53 32.3 2-苯基巴豆醛 - 3.4 54 37.81 5-甲基-2-苯基-2-己烯醛 - 1.3 55 4.56 丙酮 13.9 46.2 56 5.81 2-丁酮 - 28.9 57 8.09 2-戊酮 4.6 5 58 8.3 2,3-戊二酮 - 4.8 59 8.85 羟基丁酮 - 2.3酮类 60 16.51 2-庚酮 32.9 -61 19.1 2,6-二甲基-3-庚酮 - 9.4 62 19.39 6-甲基-2-庚酮 7 -63 20.94 4,6-二甲基-2-庚酮 - 7.4 64 23.63 2-壬酮 - 3.3 65 24.24 苯乙酮 - 12 66 34.17 3,4,4-三甲基-2-环戊烯酮 - 2.4 67 8.74 2,5-二甲基-呋喃 2.2 1.2 68 12.57 2-氰基呋喃 - 1.8呋喃（酮） 69 26.99 4-羟基-2-乙基-5甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF-1) 28.3 -70 27.3 4-羟基-5-乙基-2 甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF-2) 50.8 -71 29.49 2-甲基-3-甲氧基-4(H)呋喃酮 1.3 1.6 72 30.67 3-苯基呋喃 2.5 2.7 73 34.79 5-戊基-2(3H)-呋喃酮 4.2 2.2 74 13.6 2-甲基吡嗪 4.4 -75 17.53 2,6-二甲基吡嗪 21 -吡嗪(5) 76 21.32 2-乙基-6-甲基吡嗪 9.4 -77 22.09 2-乙烯基-6-甲基吡嗪 6.8 1.7 78 24.71 2,6-二乙基吡嗪 4.7 -79 25.17 愈创木酚 10.4 7.1 80 26.1 麦芽酚 - 30.7酚类 81 28.36 4-乙基苯酚 47.2 12.7 82 32.47 4-乙基愈创木酚 4.2 26.6

注：“-”表示未检出。

图4 两种酱油风味物质种类（a）和总峰面积（b）的对比Fig.4 Comparison of types (a) and total peak area (b) of flavor compounds in two kinds of soy sauces

根据表4及图4可知，相同发酵工艺条件下，不同原料酿造的酱油风味物质种类及总峰面积差异显著。黄豆酱油、黑豆酱油的总风味物质种类分别有63种、59种；总峰面积分别为 297.6×107、213.6×107。两种酱油酯、醇、醛种类及含量相对最多，推断酯类、醇类及醛类是酱油中的主要挥发性成分。其中黄豆酱油醇香突出，黑豆酱油醇香、酯香等香味均衡。呋喃、吡嗪类物质含量虽不高，但风味阈值低，对酱油风味影响大[31]，是酱油中特有的香气成分[32]。

黄豆酱油与黑豆酱油醇类物质含量最高，分别占挥发性物质总量的59.30%、34.73%，主要来源于酵母转化醛类物质、氨基酸与糖类物质的有氧反应[33]，是形成酱油香气成分的重要来源[31]。其中乙醇（59.04%）、苯乙醇（26.32%）是黄豆酱油中含量最高醇类物质；乙醇（83.09%）、糠醇（8.96%）是黑豆酱油中含量最高醇类物质。只在黄豆酱油中检测到的苯乙醇是酱油中的关键风味物质[34]，能够赋予花香、甜香。具有刺激性酸香的乙酸是酱油香气的主成分之一，对酱油的风味起到积极作用[13]，黄豆酱油乙酸显著高于黑豆酱油（p＜0.05），促使黄豆酱油味感协调，风味丰满。通过比较分析两种酱油发现，黄豆酱油呋喃及吡嗪类物质种类、含量更多，因此能够获得较多焙烤或坚果等风味[35]。另外，HEMF作为酱油焦糖香的主要来源，只在黄豆酱油中检测到。

此外，酯类、醛酮类及酚类物质是酱油香气组成的重要成分，通过分析发现黑豆酱油含量均高于黄豆酱油。酯类物质广泛存在于发酵食品中，其挥发性高、阈值较低[36]，具有果香并使酱油呈浓郁的酯香，能起到掩盖不良风味或减淡咸味的作用[37]。

研究表明[38]，醛类物质可由游离氨基酸脱氨、去羰基反应或美拉德反应生成，黑豆酱油氨基酸底物高可促进醛类物质的生成量。愈创木酚、4-乙基愈创木酚等能为酱油带来烟熏味或熏烤味，调节咸味、增强酱油圆润感，虽然在酱油中含量很低，但通常被认为是酱油中较为重要的香气组分[39]。值得注意的是，麦芽酚是一种风味活性物质，伴有浓郁的果香及焦糖风味，只在黑豆酱油中检测到。

3 结论

采用高盐稀态酱油制备法，以黄豆、黑豆为蛋白原料来制备黄豆酱油、黑豆酱油。测定酱油基本营养成分，发现黑豆酱油的总氮、氨基态氮、还原糖、总酸、总固形物含量均显著高于黄豆酱油（p＜0.05）。此外，黄豆酱油总氨基酸及鲜味氨基酸稍高于黑豆酱油。经4种抗氧化评价方法分析，发现发酵1个月以上成品黑豆酱油抗氧化活性比黄豆酱油强。通过相关性分析，表明总酚、总黄酮及类黑精是赋予酱油抗氧化能力的影响因子。采用HS-SPME-GC-MS技术分析酱油风味物质，发现两种酱油风味物质种类及含量差异显著（p＜0.05），其中黄豆酱油主要挥发性化合物为醇类59.30%、酯类17.83%、醛酮类10.54%、酸类4.91%、呋喃类 3.00%，黑豆酱油主要挥发性化合物为醇类34.73%、酯类28.67%、醛酮类27.64%、酸类3.72%。综合分析表明黄豆酱油醇香突出，黑豆酱油主要挥发性成分较均衡，风味协调。