重组人可溶性血栓调节蛋白对小鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及机制研究

黄山鉴，韦贵宁，姚人银，邓小玲，黄祖贵

[1.广西医科大学第十附属医院（钦州市第一人民医院）药剂科，广西 钦州 535000；2.广西中药与天然药物工程技术研究中心，广西 南宁 530022]

脑卒中是致死和致残主要病因之一。大约80%急性脑卒中是缺血性脑卒中，其中25%～35%是由于大血管阻塞引起的[1]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box protein1, HMGB1）在机体各组织中广泛表达，包括大脑。脑卒中患者血浆HMGB1水平增高；而在小鼠脑缺血模型中，缺血性脑组织可释放HMGB1[2]。此外，有研究报道，脑缺血后HMGB1进入细胞外液，诱导缺血脑组织神经炎症及小胶质细胞激活，从而使缺血损伤增重[3]。血栓调节蛋白是一种细胞表面糖蛋白，在多种细胞表面表达。血栓调节蛋白可与HMGB1 D1结构域结合具有抗炎作用[4]。在一些动物模型中，重组人可溶性血栓调节蛋白（recombinant human soluble thrombomodulin alpha, ART-123）与HMGB1表达有关联，如急性肺窘迫综合征、败血症和痛觉过敏等[5-6]。然而，目前没有研究评估ART-123是否通过调节HMGB1在小鼠脑缺血/再灌注损伤中发挥神经保护作用。因而，本研究目的是评估ART-123是否能改善小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）后脑缺血性损伤，并评估HMGB1在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

40只雄性BALB/c小鼠，体重22～28 g，购自广西医科大学动物中心。室温下自由饮食和饮水。将BALB/c小鼠随机分成：Sham组（n=10）、Vehicle组（n=10）和ART-123组（1和5 mg/kg 各10小鼠）。Vehicle组和ART-123组小鼠均在MCAO后4 h静脉注射蒸馏水或ART-123（溶于蒸馏水配成1和5 mg/kg溶液）。

1.2 实验试剂

ART-123（日本朝日化学公司），TTC（美国Sigma公司），HMGB1 ELISA试剂盒（上海内含子生物科技有限公司）。

1.3 MCAO诱导脑缺血/再灌模型

腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.06 g/kg）麻醉BALB/c小鼠，然后颈部进行手术操作。最终在显微镜下可以观察到左侧颈动脉鞘，然后分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。然后用缝合线结扎颈总动脉近心端和颈外动脉远心端，用针头在颈外动脉远端动脉壁上扎1个小口，将准备好的线栓从颈外动脉小孔插入颈总动脉，通过颈内动脉最后到达大脑中动脉，用缝合线固定线栓，MCAO后4 h拔出线栓，缝合小鼠皮肤，再灌注24 h。Sham组小鼠进行相关手术操作，但不插入线栓。

1.4 评估脑梗死体积与出血量

神经行为学评分后，将小鼠迅速断头取脑，放入-20℃冰箱冷冻约15 min后，行冠状切片，厚度为2 mm。采用图像分析系统（NIH图像，版本1.63）测定每个脑片出血面积，并计算出血量。然后将脑片放入1% TTC磷酸盐缓冲液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。脑梗死区域不染色（灰白色），而正常脑组织染为深红色。依据相关研究[7]方法计算MCAO后脑梗死体积。

1.5 神经行为学评分

小鼠MCAO 4 h后，再灌注24 h，按照文献报道的方法[8]进行神经行为学评分，评分范围是0～5分。0分为正常运动功能；1分为动物尾巴抬起时躯干和对侧前肢屈曲；2分为同侧旋转，但静止时姿势正常；3分为对侧旋转；4分为向同侧滚动；5分为静止时时向同侧倾斜（无自发性运动活动）。

1.6 旋转杆试验

通过旋转杆试验测定小鼠的运动协调能力[8]，把小鼠被放置在直径3 cm防滑的杆上，杆以10 r/min速度旋转，记录小鼠从杆上跌下的时间。

1.7 ELISA分析

采集小鼠MCAO后再灌注24 h的血液样本，离心后获得血浆（1 200 r/min×10 min），按照ELISA规定的步骤检测血浆HMGB1浓度。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析；并行Turkey's post hoc检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ART-123对脑梗死体积的影响

平均脑梗死体积Vehicle组为（93.2±7.0）mm3，ART-123（1 mg/kg） 为（76.7±7.4）mm3，ART-123（5 mg/kg）为（64.8±6.5）mm3。方差分析显示，3组脑梗死体积差异有统计学意义（F=4.843，P=0.038）。与Vehicle组比较，ART-123（5 mg/kg）组小鼠梗死体积减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 ART-123对神经行为学评分和运动协调的影响

平均神经学评分Vehicle组为（3.6±0.3），ART-123（1 mg/kg）组为（3.5±0.3），ART-123（5 mg/kg）组为（2.9±0.3）。3组间比较差异无统计学意义（F=2.564，P=0.084）。

在旋转杆试验中，平均跌落时间Sham组为（120.0±7.5）s，Vehicle 组为（22.3±12.5）s，ART-123（5 mg/kg）组为（66.2±9.9）s。方差分析显示，各组间比较差异有统计学意义（F=7.042，P=0.013）。与Sham组比较，Vehicle组小鼠运动协调能力降低（P＜0.05）。而 ART-123（1、5 mg/kg）可改善 MCAO后小鼠的运动协调能力（P＜0.05）。见图2。

2.3 ART-123对血浆HMGB1浓度影响

平均血浆HMGB1浓度Sham组为（18.3±3.82）ng/ml，Vehicle组为（37.2±3.15）ng/ml，ART-123（1 mg/kg） 组 为（20.7±3.82）ng/ml，ART-123（5 mg/kg）组为（14.8±3.16）ng/ml。方差分析显示，各组间比较差异有统计学意义（F=9.673，P=0.012）。与Sham组比较，Vehicle组平均血浆HMGB1浓度增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。ART-123（1 mg/kg）和 ART-123（5 mg/kg）均可降低Vehicle组血浆HMGB1浓度（均P＜0.05）。结果表明ART-123能降低血浆HMGB1浓度。见图3。

2.4 ART-123对出血体积的影响

平均出血体积Vehicle组为（3.48±2.43）mm3；ART-123（1 mg/kg）为（6.92±3.27）mm3；ART-123（5 mg/kg）为（5.18±2.58）mm3。3组出血体积差异无统计学意义（F=1.071，P=0.164）。见图4。

图1 ART-123对MCAO后脑梗死体积的影响

图2 ART-123对MCAO后运动协调的影响

图3 ART-123对血浆HMGB1浓度的影响

图4 ART-123对MCAO后出血体积的影响

3 讨论

本结果表明，再灌时注射ART-123可减少脑梗死体积，改善神经功能缺损，并降低血浆HMGB1水平，且出血并发症无变化。ART-123在4 h MCAO模型中可抑制血浆HMGB1表达。此外，脑缺血损伤后，白细胞可释放HMGB1，引起小胶质细胞活化[8]。血液和中枢神经系统细胞外HMGB1迅速增加，可诱导炎症反应[9]。LIU等[10]报道，HMGB1单克隆抗体可减少大鼠脑缺血后梗死体积，且与神经功能缺损改善相关。同时，HMGB1单克隆抗体可抑制血脑屏障通透性增加、小胶质细胞活化及促炎因子产生。重组血栓调节蛋白Solulin可减少缺血性脑卒中动物模型梗死体积，主要是通过其抗凝和抗炎性质[11]。RYANG等[12]报道，Solulin下调2 h MCAO大鼠缺血半影区炎症因子表达，并降低CD11B表达，CD11B是小胶质细胞/巨噬细胞活化标志物。本结果提示，ART-123可能下调脑缺血时HMGB1表达。以往动物模型研究HMGB1，ART-123注射剂量为1～10 mg/kg[13]。有研究报道，10 mg/kg重组组织型纤溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator, rtPA）对4 h MCAO小鼠梗死体积无影响，而且脑内大量出血[14]。因此，在本研究中选择ART-123剂量1和5 mg/kg。本研究表明，ART-123减少脑梗死体积且无出血改变。由于ART-123可结合凝血酶，所以具有抗凝作用，但是5 mg/kg ART-123未增加出血量。日本ART-123第3阶段临床试验表明，ART-123注射7 d后出血相关不良事件发生率低于肝素组[15]。本结果表明，ART-123是一种较安全治疗缺血性脑卒中药物。此外，Solulin通过其抗凝和抗炎作用可减少缺血性脑卒中动物模型梗死体积，模型中MCAO时间为30、60或120 min[11-12]。而本研究表明，ART-123改善4 h MCAO引起的缺血损伤。rtPA是临床唯一批准用于缺血性脑卒中溶栓治疗的药物，但是在脑卒中发作4.5 h内使用才有效果[16]。然而，不到10%急性脑卒中患者符合rtPA治疗[17]。但本研究结果提示，ART-123有可能用于治疗延迟性缺血性脑卒中。

总之，ART-123可能通过抑制血浆HMGB1表达，降低小鼠脑缺血所致神经功能缺损，而且出血并发症无明显变化。