北柴胡耐湿害株系HB-1601的生根诱导组织培养条件研究

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(西南科技大学生命科学与工程学院，　四川 绵阳 621010)

柴胡为常用大宗药材，在我国临床应用已有2 000余年的历史。《中国药典》2010版一部规定正品柴胡药材为伞形科植物北柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狭叶柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的干燥根[1]。柴胡作为传统的中药材，具有和解表里、疏肝升阳、镇痛、镇静、保肝、止咳等功能。因其需求量的不断增加，我国柴胡野生资源日渐减少，导致我国目前正面临着柴胡药用资源短缺的问题，因此柴胡的驯化栽培极为重要。为选育高产高效的柴胡品种、探索适宜的栽培方式，得到药效高、遗传稳定、适合大面积生产，满足市场需求的柴胡药材，我国许多地区很大程度上发展柴胡人工种植。本研究中所采用的HB-1601柴胡来自湖北高雨量地区，在四川地区种植时表现出优良的耐湿、耐草和抗逆性，是一份很好的遗传资源。但是该株系在四川地区开花结籽时恰逢雨季，致使其不能结实。为了更好的繁育保存HB-1601，并充分利用其抗逆性遗传位点，开展HB-1601的组织培养工作非常必要。本课题组前期对北柴胡新品种中柴2号组织培养工作进行了系统研究[2]，但是HB-1601在组织培养过程中出现种质差异性，其不能很好的生根，因而针对此材料进行生根研究以保证它的田间繁殖对北柴胡抗逆性遗传改良非常重要。

1　材料与方法

1.1　供试材料及保存

供试材料HB-1601系本课题组于湖北神农架地区采集，种植于安县资源圃原始株，经北京药用植物研究所魏建和研究员鉴定为北柴胡。

参考刘茹等[3]的方法，以其带侧芽茎段为材料诱导愈伤组织进而诱导得到丛生芽，以其无菌苗为实验材料进行生根诱导。

1.2　方　法

1.2.1增殖实验材料

将丛生芽在无菌环境中接种到以MS培养基为基础培养基中，培养基中添加质量分数为3%的蔗糖，0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IAA，在20 ℃、80%相对湿度、光照强度1 800 lx、光照12 h，黑暗12 h的培养条件下培养30 d。得到大量无菌幼苗。

1.2.2诱导柴胡不定根试验设计

分别对NAA(0.1，0.3，0.5 mg/L)、IBA(0.1，0.5，1.0 mg/L)、IAA(0.1，0.5，1.0 mg/L)3种调节激素的3个水平下的柴胡不定根的生长状况进行考察，以1/2 MS培养基为基础培养基，培养基中添加质量分数为3%的蔗糖，重复5次，同时进行空白试验(表1)，培养条件同1.2.1。考察不定根的生长个数，筛选对诱导柴胡不定根有正向效应的激素浓度。

1.2.3柴胡指标的测定

将培养的柴胡无菌苗移栽到诱导不定根的培养基中30 d后，得到很多不定根系，发现不同培养基对组织生根影响显著，考察不定根个数、根长、叶绿素、鲜重及干重。

表1诱导柴胡HB-1601不定根单因素(mg/L)

因素(mg/L)水平12345678910NAAck0.10.30.5IBAck0.10.51.0IAAck0.10.51.0

2　结果与分析

试验采用SPSS软件进行方差分析。方差分析结果表明，不同的培养基对柴胡的主根数、鲜重、叶绿素均有显著影响，对柴胡的平均根长有极显著影响，而对柴胡的干重影响不显著(表2)。重复对不定根数、根长、鲜重、叶绿素及干重等5个指标影响都不显著(p>0.05)。

表2不同生长激素对柴胡HB-1601各测定指标的方差分析

性状SSdfMSFSig组间方差239.657926.6292.8250.013不定根数组内方差339.3369.45总和578.95745组间方差26.48692.9433.5540.003根长组内方差29.808360.828总和56.29445组间方差3534748.3179392749.8132.160.049鲜重组内方差6546051.1136181834.753总和1.01E+0.745组间方差774.629986.072.1640.049叶绿素组内方差1431.9963639.778总和2206.62545组间方差52151.85295794.650.9260.515干重组内方差225355.04366259.862总和277506.89245

对NAA、IBA、IAA 3种调节激素的3个水平下柴胡的生长状况进行多组样本间差异显著性分析(表3，图1)，各调节激素对北柴胡生长影响如下：

NAA、IBA、IAA 3种调节激素对诱导北柴胡不定根均有正向效应。当NAA浓度为0.1 mg/L时诱导效果显著高于另外2种浓度；当调节激素为IBA时，0.5 mg/L和1.0 mg/L 2种浓度的诱导效果相同，诱导效果显著；当IAA浓度为0.1 mg/L时诱导效果显著高于另外2种浓度。综合比较各激素对不定根数的诱导效果认为，IBA的诱导效果最佳，其中0.5 mg/L和1.0 mg/L的IBA激素对诱导不定根数效果为极显著。

NAA、IBA、IAA 3种调节激素对北柴胡根长生长均有影响。NAA调节激素对柴胡根长生长有负效应，其中0.5 mg/L浓度的NAA抑制作用最为明显，可见NAA激素不利于柴胡根的生长；IBA、IAA 2种调节激素3种不同的浓度水平下对对柴胡根长生长均有正向效应，其中浓度为0.5 mg/L的IBA诱导效果为显著。综合比较各激素对根长影响效果认为，0.5 mg/L的IBA促进根长生长效果最佳。

表3不同生长激素中柴胡HB-1601的生长差异

培养基不定根数根长(cm)鲜重(g)叶绿素干重(g)12.75a2.45abc871.33a42.28ab207.13ns27.6bc2.16ab1307.1abc54.32c259.34ns37.2abc1.46a1195.86abc50.7bc230.48ns45ab1.24a942.08ab43.94ab197.78ns55.75abc3.01bc963.23ab45.7abc185.53ns610c3.63c1586.33bc44.85abc269.13ns710c2.99bc1646.5c46.1abc257.32ns88bc3.21bc1026.1abc40.4a190.5ns95.5abc2.85bc1118.03abc47.85abc184.65ns103.8ab3.22bc786.5a42.38ab173.54ns

注：显著性(p<0.05)。

表4不同激素浓度对柴胡HB-1601测定指标的影响

激素及浓度(mg/L)不定根数增长率(%)根长增长率(%)鲜重增长率(%)叶绿素增长率(%)干重增长率(%)NAA0.1176-11.805028.50∗25NAA0.3161.81-40.5737.2519.9311.28NAA0.580.81-49.388.122.46-4.51IBA0.1109.0922.4510.548.11-10.43IBA0.5263.64∗48.58∗82.065.4529.93IBA1.0263.6∗22.0488.97∗9.1724.2IAA0.1190.0931.0017.76-4.44-8.03IAA0.510016.3328.3113.19-10.85IAA1.038.1831.43-9.740.2516.21

注：“*”表示p<0.05。

注：a为ck，b为0.1 mg/L NAA，c为0.3 mg/L NAA，d为0.5 mg/L NAA，e为0.1 mg/L IBA，f为0.5 mg/L IBA，g为1.0 mg/L IBA，h为0.1 mg/L IAA，i为0.5 mg/L IAA，j为1.0 mg/L IAA。图1　不同生长激素对柴胡HB-1601根生长的影响

NAA、IBA、IAA 3种调节激素对北柴胡鲜重均有影响：NAA、IBA 2种激素3种不同的浓度水平下对柴胡的鲜重均有正向效应，其中1.0 mg/L的IBA对北柴胡鲜重的影响为极显著；当调节激素为IAA时，0.1 mg/L和0.5 mg/L的浓度对柴胡鲜重有正向效应，1.0 mg/L的浓度有抑制作用。综合比较各激素对柴胡鲜重的影响效果认为，浓度为1.0 mg/L的IBA效果最佳，有极显著影响。

NAA、IBA、IAA 3种调节激素对北柴胡鲜重均有影响：NAA、IBA 2种调节激素3种不同水平对诱导柴胡叶绿素含量均有正向效应，其中NAA浓度为0.1 mg/L时效果显著。当调节激素为IAA，浓度为0.1 mg/L时对诱导叶绿素含量表现为抑制作用，浓度为0.5 mg/L时有明显的正向效应，浓度为1.0 mg/L时无明显效果。综合比较，各激素对诱导柴胡叶绿素含量的影响效果认为，浓度为0.1 mg/L的NAA有显著影响，效果最佳。

分析结果表明，各激素对柴胡的干重影响不显著，这可能是取样量太少导致的结果。

3　结论与讨论

四川省青川县马公及周边地区野生柴胡资源丰富，分布较广，已有300多年种植历史，是柴胡的著名道地产区。目前我国选育的北柴胡新种包括中柴1号、中柴2号、中柴3号和川北柴1号4个品种[4]。其中中柴1～3号品种广泛分布于我国东北、华北、西北、华东等地[5]。川北柴1号系四川首个北柴胡审定新品种，该品种在多年多点区域试验中较四川地方栽培种及中国主要柴胡品种中柴1号表现出显著产量及药效品质。但川北柴1号是中柴2号在四川多年多点引种试验中逐步驯化育成，其田间耐湿、耐草性较差。北柴胡品系HB-1601是本课题组在湖北高雨量地区的一种特异性资源，在安县资源圃实验地种植多年，表现为较高的耐草性和耐涝性，是一份很好的遗传资源，适宜于对川北柴1号的耐湿抗草性改良。但HB-1601在四川地区开花授粉时恰逢雨季，致使其不能结实，因此为开展HB-1601的组织培养工作对突破性柴胡新品种选育极为重要。

目前柴胡属植物组织培养工作报道较多。姚智等对北柴胡愈伤组织和诱导不定根进行了研究，结果表明，柴胡的愈伤组织适宜于在MS+NAA 4 mg/L+KT 0.2 mg/L的培养基上进行继代培养，或MS+NAA 2 mg/L+KT 0.2 mg/L的培养基上进行继代培养，而诱导不定根宜采用MS+IBA 2 mg/L+KT 0.2 mg/L，MS+IBA 1 mg/L+KT 0.2 mg/L或MS+IAA 8 mg/L+KT 0.2 mg/L的培养基[7]。杨东方等研究了柴胡外植体采样时期、大小和种类等因素对诱导愈伤组织的影响，结果表明，4月上旬所采集的北柴胡的根是诱导愈伤组织最适宜的材料，长1.0 cm左右的根切段有利于愈伤组织的诱导和生长，在添加IBA 0.5 mg/L的1/2 MS培养基中，带侧芽茎段不定根的诱导率可达97.3%[6]。郝建平等研究了北柴胡愈伤组织叶片、茎段及花芽愈伤组织的诱导、分化和不定芽增殖的条件，并得出NAA 0.5 mg/L的1/2 MS培养基是生根的适宜培养基的结论[8]。综合本研究中各激素对上述测定指标的影响效果，认为浓度为0.5 mg/L的IBA是诱导柴胡生根的最佳组培条件。杨东方等[6]在北柴胡不定根培养中也得出来同样结果。

本研究发现，北柴胡HB-1601与其他北柴胡间存在种质差异，其中芽诱导的组培条件基本一致，而生根培养存在差异性。因此，总结前人经验针对本研究中HB-1601做了一个特异性的生根诱导方案，旨在为保存此特异性种子遗传资源提供科学依据，供遗传改良用，并非为了满足生产要求。