长链非编码RNA SNHG6在结肠癌中的表达及其生物学意义

黎丰华，古国财，庄雄标，吴印爱，刘献棠，王志伟

(广州军区广州总医院157分院普通外科，广州 510515)

结肠癌是人类主要恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别位于第3位和第4位。每年约有120万新确诊的结肠癌患者，并且有超过60万例患者死于结肠癌[1]。肿瘤转移与肿瘤患者的预后直接相关，当结肠癌确诊时，已经有20%～40%患者发生远处转移，目前结肠癌外科手术治疗的5年生存率在50%左右[2-3]。因此，分析结肠癌的生物学特性，探索其复发转移机制是临床研究关注的问题。核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)是一类对恶性肿瘤具有重要生物学调控作用的长链非编码RNA(lncRNAs)[4-7]。既往研究报道SNHG6在肝细胞癌中表达明显上调，并提示肿瘤患者的高复发可能性[8]。然而，目前尚缺少SNHG6对结肠癌生物学作用影响的报道，本文将探究SNHG6在结肠癌组织中的表达特点，及其对结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1细胞与组织来源 试验所用结肠癌组织和相应癌旁组织(距癌灶边缘至少2 cm)均为离体30 min内转移至-80 ℃冰箱保存的新鲜标本，取自2014年1月至2015年10月在本院行根治性手术治疗的25例结肠癌患者，所有患者术后均经病理学检查确诊，术前未行放化疗等抗肿瘤治疗。LoVo结肠癌细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2仪器与试剂 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)，荧光定量PCR引物序列(上海生工公司)，DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国HyClone公司)，Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)，SNHG6-siRNA干扰序列(广州锐博公司)，CCK-8(cell counting kit 8)细胞增殖检测试剂盒(上海碧云天公司)，Matrigel基质胶和Transwell培养板(美国Conirng公司)，上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail和β-actin兔抗人多克隆抗体(美国Abclonal公司)。CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，实时荧光定量PCR检测系统(美国ABI公司)，蛋白质印迹法(Western blot)检测系统(美国Bio-rad公司)。

1.3方法

1.3.1LoVo细胞培养、转染和分组 LoVo细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。为探讨敲低SNHG6表达对LoVo细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，取对数生长期细胞按照Lipofectamine 2000说明书进行细胞转染处理，分为4组：空白组(Blank组，不加任何处理)，阴性对照组(NC组；5 μL Lipofectamine 2000+50 pmol NC-siRNA)，第1干扰组(siRNA-1组，5 μL Lipofectamine 2000+50 pmol SHNG6-siRNA-1)及第2干扰组(siRNA-2组，5 μL Lipofectamine 2000+50 pmol SHNG6-siRNA-2)。4组分别处理48或72 h后进行下一步实验。

1.3.2结肠癌组织和LoVo细胞SNHG6及细胞上皮-间质转化(EMT)标志物mRNA表达水平的检测 Trizol法提取组织或者细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板按照SYBR Green Ⅰ法进行目的基因的荧光定量PCR反应。SNHG6引物：上游5′-ATA CTT CTG CTT CGT TAC CT-3′，下游5′-CTC ATT TTC ATC ATT TGC T-3′；EMT标志物能够反映细胞的EMT进程，主要包括上皮细胞标志物E-cadherin、间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin，以及抑制上皮细胞特性的转录因子Snail。各目的基因引物序列见表1，采用2-ΔΔCT法表示目的基因的相对表达水平，以β-actin作为内参。

表1 EMT标志物的引物序列

1.3.3LoVo细胞增殖能力的检测 采用CCK-8法，收集处理24 h后的细胞接种于96孔板，接种密度为1 000个/孔，培养体系为100 μL，继续常规培养，分别取0、24、48、72 h等培养时间点，加入10 μL CCK-8试剂，培养箱孵育2 h后，450 nm波长下测定光密度值(OD值)，绘制细胞生长曲线。

1.3.4LoVo细胞迁移和侵袭能力的检测 采用Tranwell法检测，收集处理48 h后的细胞，将不含胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞接种于Transwell培养板上室，接种密度为5×104个/孔，培养体系为200 μL，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，常规培养24 h后取出上室，以4%多聚甲醛固定细胞20 min，0.5%结晶紫染色25 min，以棉签擦去上室内侧细胞，充分洗涤，干燥后倒置显微镜下随机选择5个高倍视野进行观察，统计穿膜细胞数。迁移实验和侵袭实验方法基本一样，后者所使用小室经10% Matrigel基质胶包被处理。

1.3.5LoVo细胞EMT标志物表达水平的检测 采用Western blot检测，收集处理72 h后的细胞，提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，取30 μg样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)及β-actin(1∶2 000)等一抗4 ℃孵育过夜，PBST漂洗3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔二抗(1∶15 000)室温孵育1 h，PBST漂洗3次，电化学发光法(ECL)显色并采集图像。

2 结 果

2.1结肠癌组织和癌旁组织中SNHG6 mRNA表达水平比较 荧光定量PCR结果显示，结肠癌组织SNHG6 mRNA相对表达水平2.37(0.93，3.66)高于癌旁组织1.5(1.00，2.00)，差异有统计学意义(U=138.0，P=0.000 7)，见图1。

注：**P<0.01，与癌旁组织比较

图1结肠癌组织和癌旁组织SNHG6水平比较

2.2SNHG6-siRNA对LoVo细胞SNHG6 mRNA表达水平的影响 LoVo细胞转染siRNA后，Blank组SNHG6 mRNA相对表达水平为(0.94±0.05)，NC组为(1.03±0.07)，siRNA-1组为(0.24±0.07)，siRNA-2组为(0.34±0.14)，组间比较差异有统计学意义(F=63.04，P=0.000)；进一步两两比较，siRNA-1组、siRNA-2组SNHG6 mRNA相对表达水平较Blank组明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，SNHG6低表达细胞模型构建成功，满足下一步功能实验需要，见图2。

注：**P<0.05，与Blank组比较

图2 4组LoVo细胞SNHG6相对表达水平比较

2.3敲低SNHG6表达对LoVo细胞增殖能力的影响 LoVo细胞转染siRNA 后，4组细胞培养24、48、72 h后的增殖活性比较，差异有统计学意义(F=18.6、160.3、32.7，P=0.000)，见表2；进一步两两比较，siRNA-1组、siRNA-2组细胞的增殖活性较Blank组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 4组细胞的增殖活性比较±s)

注：**P<0.05，与Blank组比较

2.4敲低SNHG6表达对LoVo细胞的迁移和侵袭能力的影响 LoVo细胞转染siRNA 后，Transwell迁移实验显示，Blank组穿膜细胞数为(148.6±10.9)个，NC组为(150.2±11.9)个，siRNA-1组为(53.0±14.1)个，siRNA-2组为(35.4±20.5)个，组间比较差异有统计学意义(F=85.38，P=0.000)；进一步两两比较，siRNA-1组、siRNA-2组细胞发生迁移的数量较Blank组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。Tranwell侵袭实验显示，Blank组穿膜细胞数为(126.8±6.9)个，NC组为(139.6±4.2)个，siRNA-1组为(40.2±7.5)个，siRNA-2组为(42.8±8.6)个，组间比较差异有统计学意义(F=289.8，P=0.000)；进一步两两比较，siRNA-1组、siRNA-2组细胞发生侵袭的数量较Blank组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.5敲低SNHG6表达对LoVo细胞EMT进程的影响 LoVo细胞转染siRNA后，荧光定量PCR结果显示，4组细胞EMT标志物mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步两两比较，siRNA-1组、siRNA-2组E-cadherin相对表达水平高于Blank组，N-cadherin、Vimentin、Snail表达水平低于Blank组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。 Western blot结果显示，LoVo细胞转染siRNA后，siRNA-1组、siRNA-2组E-cadherin蛋白表达上调，N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达下调，见图4。

A：4组细胞迁移和侵袭情况(结晶紫染色，×200)；B：4组细胞的迁移和侵袭数量比较；*：P<0.05，与Blank组比较

图3 4组LoVo细胞的迁移和侵袭细胞数比较

注：**:P<0.05,与Blank组比较

图4 4组LoVo细胞EMT标志物蛋白表达水平比较

3 讨 论

非编码RNAs(ncRNAs)是不具有蛋白质编码功能的RNAs，其中长度超过200个核苷酸的ncRNAs称为lncRNAs。通过高通量测序和组织芯片技术，研究者发现了成千上万的lncRNAs。越来越多的研究表明，lncRNAs参与了各种生理或病理过程的调节，其异常表达与多种人类疾病有关，如癌症[9]、阿尔茨海默症[10]及心脏病[11]。目前只发现少数lncRNAs与人类癌症的发生、发展有关，lncRNAs在癌症中的生物学功能尚不明确[12-13]。近期研究显示，SNHGs在恶性肿瘤的病理过程中存在差异表达。ZHAO等[7]发现SNHG5具有抑制胃癌发生的作用，其在胃癌组织的表达水平较癌旁组织下调；而陈宝珍等[14]报道，SNHG8在胃癌发生、发展中可能扮演原癌基因角色。本研究发现，SNHG6 mRNA高表达于结肠癌组织，与既往对肝细胞癌的研究报道一致[15]。该研究也指出，SNHG6可参与调节肝癌细胞的增殖和凋亡等过程；进一步研究发现，SNHG6通过与ZEB1、miR-101-3p等分子相互作用，调节肝癌细胞周期、凋亡等多种通路，从而引起肿瘤细胞的增殖、迁移等多种生物行为的改变[15]。本研究也发现，下调SNHG6的表达能够明显抑制结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，提示SNHG6通过调控结肠癌的增殖和迁移影响肿瘤的发生、发展。

EMT是指上皮细胞失去其上皮特性，而向间质细胞转化的过程，该转变有助于肿瘤获得更强的迁移和侵袭能力，是肿瘤发生转移和复发的关键环节[16-17]。细胞发生EMT时，往往表现为E-cadherin等上皮表型表达下调，而N-cadherin、Vimentin等间质表型表达上调[18]，该过程可以受许多因素调控，其中EMT相关转录因子Snail可以通过抑制E-cadherin的表达而促进EMT[19]。本研究发现，下调SNHG6表达后，LoVo细胞内E-cadherin表达上调，而N-cadherin、Vimentin及Snail均表达下调，说明敲低SNHG6的表达可以抑制结肠癌细胞的EMT过程，该抑制作用可能导致细胞迁移和侵袭等恶性生物学特性下降。

综上所述，本研究发现SNHG6在结肠癌中高表达，并可能通过调节结肠癌的增殖、迁移及侵袭能力而发挥促癌作用；SNHG6参与调节肿瘤的EMT过程，这是其促进结肠癌增殖和转移的可能机制之一。但本研究也存在诸多不足，如研究样本量还不够大、缺少FISH实验证实SNHG6基因的高表达、细胞实验深度不够等；SNHG6通过何种机制调控结肠癌进展，也需要继续深入研究。

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