基于WNT／β-catenin通路研究石斛合剂对衰老糖尿病大鼠脂代谢的调控机制

刘 赟 ，林心君 ，施 红 ，许 茜

（1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

目前，全世界糖尿病患者日趋增多，据世界卫生组织估量，至2050年，全球糖尿病患者将超过3亿。糖尿病患者存在脂代谢紊乱的情况，而肝脏脂代谢的异常又能促进2型糖尿病的发展。有研究表明，慢性游离脂肪酸的升高和胰岛细胞内脂质的增加能促使胰岛β细胞凋亡；高脂血症又使糖尿病患者心血管疾病的发病率增加，因此在治疗糖尿病的同时要积极降低患者的血脂［1］。石斛合剂具有滋阴、清热、益气、活血、泻浊等功效，通过以往的研究发现，该合剂能够降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂，并且其作用显著优于西药二甲双胍［2-3］。本研究通过对衰老糖尿病大鼠肝脏基因芯片的分析，探讨石斛合剂调控衰老糖尿病大鼠肝脏脂代谢的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 50只12周龄SPF级雌性Wistar大鼠，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。

1.2 实验药物 石斛合剂1、2号方：石斛、黄芪、五味子、丹参等，3号方：茵陈、大黄、栀子、五味子等。盐酸二甲双胍缓释片（广东省药物研究所制药厂）。

1.3 实验试剂和仪器 乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20100310）；基因表达谱杂交试剂盒（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#5188-5242）；基因表达谱洗片试剂盒（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#5188-5327）；兔抗鼠-β-catenin多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）；基因芯片扫描仪（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US，Cat#G2565CA）；7180 型自动生化分析仪（日立公司）；FJ2008PS型γ放射免疫计数器（西安核仪器厂）。

2 实验方法

2.1 药液制备 石斛合剂1、2、3号方分别按生药含量为2.0 g／mL灭菌后100 mL分装一瓶，分装保存备用。

2.2 建立模型 适应性喂养7 d，根据课题组前期工作研究［2］，随机分为正常对照组10只和造模组40只，分别喂养基础饲料和高脂高糖饲料12个月后，造模组予腹腔注射低剂量的链脲佐菌素（STZ）20 mg／kg，注射 1次，3 d之后筛选出随机血糖≥16.7 mmol／L的衰老糖尿病模型大鼠32只，随机分为模型组10只、二甲双胍组10只、石斛合剂组12只。

2.3 干预 石斛合剂组按 12 g／（kg·d）予石斛合剂灌胃，第1～5天予石斛合剂1号方灌胃，第6～10天予石斛合剂2号方灌胃，第11～12天予石斛合剂3号方灌胃，此为1个疗程，共灌胃2个疗程；二甲双胍组按 50 mg／（kg·d）予二甲双胍灌胃；正常对照组和模型组予等量生理盐水灌胃。每日1次，共干预24 d。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 生化指标检测 动物处死后取腹主动脉血，应用自动生化分析仪检测甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和胆固醇（CHOL）。

2.4.2 HE染色 取肝脏切片常规脱腊，入水。100%酒精脱洗5 min 2次，95%酒精、80%酒精各脱洗5 min，自来水充分冲洗5 min。苏木素浸泡5 min，自来水冲洗；1%盐酸分化，自来水冲洗；伊红染液中染色2 min；依次于70%、80%、90%、95%酒精梯度酒精脱水各2 min，100%酒精10 min脱水2次，二甲苯透明后，中性树胶封片。

2.4.3 免疫组化检测肝脏β-链蛋白（β-catenin）表达量 包埋、切片、脱蜡和水化后，用自来水冲洗。对组织抗原进行相应的修复，并用 PBS冲洗3次，除去PBS液。每张片加1滴或50 μL 3%过氧化氢，在室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，各3 min。每张切片加1滴或50 μL非免疫山羊血清，室温下孵育10 min后直接甩去液体。每张切片加50 μL的第一抗体，室温下孵育60 min，PBS冲洗 3次，各3～5 min。除去 PBS液，每张切片加 50 μL即用MaxVisionTM试剂，室温下孵育 15 min，PBS冲洗 3次，各3 min。除去PBS液，每张切片加100 μL新鲜配制的DAB显色液，作用5 min，显微镜下观察。自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。设空白二甲双胍组，用PBS液冲洗，不加1抗，其余各步骤与其他切片相同。

2.4.4 基因芯片检测 取肝脏组织交由上海伯豪生物工程有限公司进行Angilent大鼠全基因组表达谱芯片测试，芯片名称为：Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray（4×44K）。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。基因芯片采用上海伯豪生物技术公司SAS在线分析系统进行生物信息学分析，计算差异倍数值（fold change，FC）。

3 结 果

3.1 4 组大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比较见表1。

表1 4 组大鼠血清 HDL、LDL、TG、CHOL 水平比较（x±s）mmol／L

3.2 肝脏HE染色 模型组肝细胞结构紊乱，细胞胞浆疏松化，有些则呈气球样变，炎细胞浸润明显，纤维组织增生，包绕汇管区；二甲双胍组和石斛合剂组肝细胞结构稍紊乱，气球样变、炎细胞浸润较模型组明显减少。见图1。

图1 4组大鼠肝脏HE染色图（×40）

3.3 免疫组化检测β-catenin 模型组β-catenin高表达，并且可见部分细胞核出现表达，大部分细胞核移位，脂肪变性较严重；二甲双胍组有部分 βcatenin表达于细胞质；但细胞核未见β-catenin表达，部分细胞核移位；石斛合剂组β-catenin表达量、核移位、脂肪变性少于二甲双胍组。见图2、表2。

图2 4组大鼠肝脏β-catenin免疫组化图（×400）

表2 4组大鼠肝脏β-catenin表达比较（x±s）

3.4 脂代谢相关基因芯片结果 见表3、4。判定标准：FC值≥2的基因为表达显著上调基因，FC值≤0.5为表达显著下调基因。

4 讨 论

2型糖尿病的患者多数存在脂代谢紊乱，而高血糖和高血脂导致糖尿病的并发症，例如动脉粥样硬化等，而动脉粥样硬化是糖尿病患者致死的首要原因［4］，长期的高血脂能降低机体各组织对胰岛素的敏感性。因此，调节糖尿病脂代谢的紊乱相当重要。传统中医认为糖尿病的病位在脾（胃）、肝、肾，多为虚实夹杂，即以阴虚或者气阴两虚为本，痰浊血瘀为标。在疾病初期多以标实为主，情志失调，继而痰浊化热伤阴；后期以本虚为主，且多为阴阳两虚，并兼有痰浊、瘀血，而痰浊和瘀血又相互影响，耗伤气血、损伤脏腑［5］。 林兰教授［6］认为糖尿病分为三型：即阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚，分别代表着糖尿病病程的早、中、晚三个时期，基本证候为气阴两虚，兼有血瘀，而阴虚则贯穿整个糖尿病的发病过程。本实验针对临床2型糖尿病本虚标实的病机特点，确立以标本兼治、扶正祛邪为主的治疗原则，先采用益气、滋阴、活血，兼以生津、清热的1、2号方，再佐以利湿泄浊的3号方，扶正与祛邪分而治之，以免功效互抵，并注意在祛邪时不伤正。本研究通过对衰老糖尿病大鼠肝脏组织基因芯片的分析，旨在探索石斛合剂治疗糖尿病，特别是调节肝脏脂代谢的相关通路，为石斛合剂治疗糖尿病的机制研究提供方向。

表3 石斛合剂组对比模型组表达明显下调的基因

表4 模型组明显下调或上调，经石斛合剂治疗后恢复正常的基因

通过对血清学的检查发现经石斛合剂治疗后衰老糖尿病大鼠血清LDL、TG、CHOL水平显著降低，HDL水平显著升高。基因芯片两两对比发现，石斛合剂组对比模型组叉头框蛋白Q1（forkhead box Q1，FOXQ1）、WNT1 诱导信号通道蛋白 2（WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2）基因表达显著下调；通过石斛合剂的治疗，模型组对比正常对照组下调的低密度脂蛋白受体相关蛋白-5（low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）、无翅型MMTV整合位点家族成员7A（wingless-type MMTV integration site family，member 7A，WNT7A）基因恢复正常表达，上调的WISP2基因恢复正常表达。FOXQ1能参与调节WNT／β-catenin信号通路，有研究表明，在肝癌的患者中FOXQ1呈高表达，而当FOXQ1沉默时可以抑制肝癌细胞血管的生成［7］。当WISP2和其他WNT激活的标志物表达增加时，能增加肥胖、内脏脂肪积累和胰岛素抵抗［8］。WNT7A属于WNT家族，能够抑制细胞增殖，促进细胞的凋亡［9］。LRP5属于低密度脂蛋白受体相关蛋白，是WNT经典通路中的一个受体，其能参与巨噬细胞的脂质吸收。WNT通路中的主要组成有配体如WNT家族分子、跨膜受体如LRP5、胞浆调节蛋白β-catenin等。β-catenin在WNT经典通路中有着相当重要的作用，有研究表明，WNT／βcatenin通路的活化不仅能增加病毒性肝炎患者病毒的表达，还能促进肝癌细胞的侵袭和迁移，使肝癌的预后不良［10-12］。通过基因芯片的研究发现石斛合剂能使衰老糖尿病大鼠LRP5、WNT7A基因恢复到正常水平，将衰老糖尿病大鼠显著上调的WISP2基因恢复到正常水平，提示石斛合剂可能主要是通过“纠偏”达到调控衰老糖尿病大鼠脂质代谢的作用；通过石斛合剂的治疗能够降低FOXQ1基因表达，提示石斛合剂可能具有抑制衰老糖尿病大鼠肝癌发生的作用。通过对免疫组化结果的分析发现，石斛合剂组、二甲双胍组β-catenin的表达量均显著低于模型组，提示石斛合剂可能是通过调节WNT／β-catenin信号通路起到抑制肝脏癌变、减少内脏脂肪积累等达到调节肝脏脂代谢的作用。

通过本研究我们发现石斛合剂能通过“纠偏”达到调节WNT／β-catenin信号通路的作用。通过对已知基因的研究发现，石斛合剂能通过控制脂肪生成，增加脂肪酸的β氧化，促进脂肪分解及脂肪酸的运输，通过调节WNT信号通路，从而降低血清LDL、TG、CHOL水平，升高 HDL水平，起到保护肝脏、减少肥胖、减轻内脏脂肪积累、降低胰岛素抵抗的作用，从而对糖尿病大鼠脂代谢起到调控的作用。

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