牛胎儿骨骼肌来源成肌细胞分化相关microRNA的筛查与鉴定

邢义珅，胡 鑫，任 玲，王亚慧，徐凌洋，李俊雅，张路培(中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

肉用动物的肌肉产量主要由肌纤维数量和截面直径直接决定[1]。胎儿期是动物骨骼肌发育的关键时期，出生后个体骨骼肌的发育主要表现为肌纤维的增大，而肌纤维的数量基本上不再增加[2]。因此，研究胎儿期的骨骼肌发育，对于肉用家畜来说具有非常重要的意义。在哺乳动物的骨骼肌发育过程中，多种细胞信号分子和转录因子参与了肌细胞的增殖和分化[3]。除此之外，microRNA(miRNA)作为一类重要的非编码RNA，通过其序列、结构、丰度和转录方式的多样性，在骨骼肌发育等许多生物过程中调控基因表达[4]。

miRNA是一类在真核生物中广泛表达的内源性小分子单链RNA，成熟后长度在22个核苷酸左右[5]。miRNA通过与靶向mRNA的3′UTR区域进行特异性的碱基互补配对，引起靶向mRNA的降解或转录活性稳定下降，抑制其翻译，从而在转录后层面抑制基因的表达[6-7]。研究发现，miRNA能够参与机体的多种生命活动，包括细胞增殖分化和凋亡、新陈代谢、疾病发生、干细胞自我更新以及肿瘤发生等[8-12]。随着研究的深入，人们对miRNA调控骨骼肌发育的理解也越来越透彻，现在已经发现众多的miRNA广泛地作用于控制细胞成肌分化的相关基因，对成肌分化产生重要影响[13]。miR-1抑制HDAC4的表达，促进非洲爪蛙肌细胞分化[4]；miR-27b可以抑制Pax3的表达，从而抑制小鼠胎儿细胞进入骨骼肌发育的过程[14]；miR-206能够作用于多个与肌肉分化相关的基因来影响动物肌肉的发育[15-16]；miR-125b能够作用于IGF-II，抑制成肌细胞的分化[17]等。

关于牛肌肉发育的miRNA已经有一些报道[18]，但大都停留在成体水平，关于胎儿骨骼肌分化相关miRNA动态变化的研究鲜有文献报道。本研究采用高通量测序技术，对牛胎儿来源的骨骼肌细胞分化始末差异表达miRNA进行筛查与鉴定，挖掘与牛胎儿期肌肉发育相关的miRNA，同时，采用荧光定量PCR技术验证测序结果的可靠性，为后续研究牛胎儿骨骼肌发育提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 成肌细胞 试验细胞来源于3头4月龄的牛胎儿背最长肌组织。试验动物相关操作符合实验动物管理条例(国家科学技术委员会，2017第3次修订)，母牛屠宰后取出子宫，迅速带回中国农业科学院北京畜牧兽医研究所分子生物学实验室，用于分离培养成肌细胞。

1.1.2 主要试剂和仪器 Ⅳ型胶原酶购自Sigma公司；低糖DMEM、胎牛血清、马血清、青链霉素双抗和胰酶购自Gibco公司；TRIzol Reagent购自Invitrogen 公司； miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit购自天根生化科技(北京)有限公司。荧光定量PCR仪为ABI Q7。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞分离和培养 用75%的乙醇对子宫进行消毒处理，用手术剪剪开子宫取出牛胎儿。用手术刀剥开胎儿背部皮肤，取背最长肌组织置于PBS中。

取约200 mg肌肉组织置于1.8 mL离心管中，用眼科剪将其剪成1 mm3大小的肉糜，加入1 mg·mL-1的IV型胶原酶(溶于低糖DMEM培养基)1 mL，放入37 ℃恒温空气浴摇床中进行消化，每隔15 min取出离心管，用移液器进行吹打。消化45 min后取出离心管，先用孔径为100 μm的尼龙网筛过滤，再用孔径为40 μm的尼龙网筛过滤，得到含有单细胞的悬液，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液后得到细胞沉淀，加生长培养基(10%胎牛血清+89% L-DMEM+1%青链霉素双抗)后接种于培养皿中。

原代成肌细胞融合度达到约70%时，用0.25%的胰酶消化传代，将细胞接种到细胞培养板中，每2 d更换1次培养基，在细胞融合度达到100%时，收取0 d的样品，同时将其它细胞更换为分化培养基(5%马血清+94% L-DMEM+1%青链霉素双抗)，每2 d更换1次培养基，培养成肌细胞至分化终末，收取样品于-80 ℃冰箱内保存。

1.2.2 总RNA的提取、质量检测及测序文库的建立 依照TRIzol试剂说明书的操作步骤来提取总RNA，用分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。取总RNA进行电泳，检验所提取总RNA的完整性。利用Aglient 2100对样品浓度精确定量。RNA样品总量、浓度、RIN值、OD260 mm/OD280 mm都符合标准后，按照Small RNA Sample pre Kit说明书步骤构建测序文库。

1.2.3 测序数据的生物信息学分析

1.2.3.1 文库上机测序和数据的预处理： 用illumina MiSeq高通量测序平台对构建好的文库进行测序，然后对测序数据进行质量评估。原始数据文件经过碱基识别分析转化为原始测序序列，分别去除低质量(质量值Q≤5的碱基数占整个read的50%以上的reads)、有5′接头污染、没有3′接头序列、没有插入片段、长度小于18 nt的reads，去除poly A的reads，最终得到clean reads。

1.2.3.2 序列分析和统计： 统计得到clean reads在长度上的分布，将clean reads与Rfam(v10.0)数据库进行比对，统计rRNA、scRNA、snRNA、snoRNA及tRNA的比例，去除5类ncRNA(non-coding RNAs)后，再与牛基因组(Bos_Taurus_Ensembl_release-80/Bos_taurus.UMD3.1)进行比对，统计比对到基因组sRNA(small RNAs)的数量。用mirDeep2(v2.0.0.5)软件检测已知miRNA。用去除了5类ncRNA的sRNAs与miRbase(v19.0)数据库进行比对，检测已知miRNA，并统计表达量。

1.2.3.3 差异表达miRNA的分析及其靶基因预测： 根据得到的成熟miRNA在各个文库中的表达量，用edgeR(v3.20.1)软件进行miRNA的差异表达分析，得到成肌细胞分化始末差异表达的miRNA。依据miRNA与其靶位点的互补性、miRNA靶位点的保守性、miRNA-mRNA双链之间的热稳定性及附近序列的二级结构等原则，综合利用miRanda(v3.3a)和RNAhybrid来预测靶基因，统计差异表达miRNA的靶基因。用topGO(v2.30.0)软件对差异表达miRNA对应的靶基因进行富集分析。

1.2.4 反转录和qPCR验证 为了验证测序结果的准确性，随机选取8个表达量较高的差异表达miRNA，分别检测其在成肌细胞分化始末的表达量。以U6作为内参，分别根据miRNA的序列设计荧光定量PCR的上游引物，下游引物由试剂盒提供(未列出)，引物信息见表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR201)说明书进行逆转录，合成miRNA对应的cDNA第一链。荧光定量PCR按照miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(FP411)说明书进行。反应体系为20 μL：2×miRcute增强型miRNA定量预混试剂(含SYBR和ROX)10 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，正向引物 (10 μL)0.4 μL，cDNA 2 μL，无核酶ddH2O补至20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共40个循环。

表1RT-PCR正向引物序列

Table1RT-PCRforwardprimersequences

引物名称Primername引物序列(5′→3′)Primersequencebta⁃miR⁃148a⁃FCGCCTCAGTGCACTACAGAACTTTGbta⁃miR⁃1⁃FCGCCGTGGAATGTAAAGAAGTATGTATbta⁃miR⁃34a⁃FCGTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTbta⁃miR⁃7⁃FCGCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTbta⁃miR⁃27a⁃5p⁃FAGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCAbta⁃miR⁃26a⁃FCGGTTCAAGTAATCCAGGATAGGCTbta⁃miR⁃199a⁃5p⁃FCGCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTbta⁃miR⁃143⁃FGGTTGAGATGAAGCACTGTAGCTCGbta⁃U6⁃FCGCTTCACGAATTTGCGTGTCATbta⁃U6⁃RGCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT

1.2.5 数据统计 用SPSS 19.0软件的t检验对数据进行显著性分析，试验数据用“平均值±标准误”表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 牛胎儿骨骼成肌细胞培养及总RNA提取

用胶原酶消化法从4月龄的牛胎儿骨骼肌中分离成肌细胞，可以看到单个细胞呈纤维状，形态比较一致，将细胞接种于培养皿中，约2 d后细胞融合度达到70%，传代至六孔细胞培养板中，每孔接种细胞约为1×105个，待细胞长满后(图1A)更换诱导培养基进行诱导分化，5 d后(图1B)可以看到，大量细胞融合形成长条状的肌管，肌管受到冷刺激时，可以进行有节律的舒缩运动，表明肌管成熟，成肌细胞分化至终末阶段。

提取总RNA，分光光度计检测显示，总RNA OD260 mm/OD280 mm>1.8，OD260 mm/OD230 mm>2.0，电泳结果显示总RNA完整性良好(图略)，无明显降解。

图1 牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞分化0(A)和5 d(B)的明场照片(标尺：100 μm)Fig.1 Bright field pictures of myoblasts isolated from bovine fetal skeletal muscle differentiated on 0(A) and 5 d(B)(bar: 100 μm)

2.2 测序结果及数据处理

2.2.1 高通量测序数据 将得到的数据进行过滤，去除污染和低质量序列后，得到序列的基本信息见表2。统计6个sRNA文库中的所有序列长度分布，大部分序列集中分布在21～24 nt，形成主峰。其中，长度为22 nt的序列频率最高，其次为23 nt的序列(图2)。

Clean reads与Rfam数据库进行比对，将比对到数据库中的sRNA进行注释，结果见图3。miRNA所占的比例分别为37.39%和42.41%。

表2各文库测序基本情况

Table2Generalinformationaboutlibraries

样品名Samplename总数Totalreads高质量序列数Cleanreads所占比例/%PercentageA0d155870051313915584．33A5d134035971180047088．08B0d152866101291049484．49B5d119509431000487683．75C0d150856401193093679．12C5d143179451255903787．75

图2 小RNA的长度分布Fig.2 Length distribution of sRNAs

图3 成肌细胞分化0(A)和5 d(B)的小RNA分类注释Fig.3 Annotation of sRNAs of myoblasts differentiated on 0 (A) and 5 d (B)

2.2.2 miRNA序列比对与统计 将过滤后的reads与牛的参考基因组比对，6个文库的比对结果见表3。其中，比对到基因组的序列比例都在70%以上，比对到基因组的sRNA种数都高于55%。

再将过滤后的reads与miRbase数据库比对，用mirDeep2软件进行统计，检测到成熟miRNA共619个。

表3文库中sRNA基因组比对结果

Table3GenomicalignmentofsRNAsfromlibraries

样品名Samplename序列种类UniquesRNAs总数Totaluniquereads比对上的序列数Matcheduniquereads百分比/%Percentage序列数TotalsRNAs总数Totalreads比对上的序列数Matchedreads百分比/%PercentageA0d18245411889265．169258913864328993．35A5d1457868466358．079056538780365986．17B0d19018211963162．906552517547334983．53B5d1308237195755．007025041554293178．90C0d16529810153761．434852204361402474．48C5d1426908441559．1610264886884547786．17

2.3 牛胎儿成肌细胞分化始末差异表达miRNA的分析

统计在不同样本间成熟miRNA的表达情况，用edgeR软件进行成肌细胞分化始末差异表达miRNA的分析，设定阈值P-value为0.05，Fold-change为2，得到差异表达的miRNA共 150个，表达量最高的20个见表4。

热图结果显示，成肌细胞分化0和5 d时，miRNA分别聚类到两个不同的类群，表明成肌细胞分化始末表达的miRNA有显著的差别(图4)。

2.4 差异表达miRNA靶基因预测及靶基因的GO与KEGG通路分析

综合利用miRanda和RNAhybrid两款软件进行差异表达miRNA的靶基因预测，150个差异表达miRNAs共预测到8 821个靶基因。

GO分析结果表明，差异表达miRNA的靶基因在生物学过程中主要参与了机体代谢和细胞代谢过程，占到靶基因总数的63.5%，其次是参与调控细胞生物学质量、细胞增殖分化和RNA转录等；在分子功能上，靶基因主要作用于蛋白质结合、酶催化和阴离子结合等；在细胞组成中，靶基因产物主要集中位于细胞内部，分别位于细胞质、细胞器膜和细胞核等(图5)。KEGG通路分析结果表明，差异表达miRNA的靶基因主要集中在MAPK信号通路、钙离子信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、缝隙连接和TRP通道介导的炎症调节过程等(图6)。

图4 差异表达miRNA的热图Fig.4 Heat map of differentially expressed miRNAs

2.5 qPCR对高通量测序准确性的验证

随机选取8个差异表达的miRNAs，进行荧光定量PCR验证，测序和荧光定量PCR得到的相对表达量如图7所示。可以看到，两种结果显示，miRNA的变化趋势完全一致，其中bta-miR-148a、bta-miR-143、bta-miR-1、bta-miR-34a、bta-miR-26a、bta-miR-199a-5p在分化5天的表达水平显著升高，bta-miR-7、bta-miR-27a-5p在分化5天的表达水平显著降低。熔解曲线都为单峰，引物特异性良好。

3 讨 论

当前，二代测序技术已经非常成熟，其通量高和信息量大的特点使其被广泛应用于畜禽基因组学研究中[19]。本研究利用illumina测序平台，对牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞miRNA进行高通量测序，鉴定已知miRNA 619个，分化始末差异表达miRNA共150个。对于高通量测序结果随机选取8个表达量相对较高的差异表达miRNAs，用加Poly A尾的方法合成cDNA，并用荧光定量PCR技术来检测miRNA的表达量，检测结果与测序结果完全一致，表明了测序结果具有较高的准确性和可靠性。这些结果将为后续研究miRNA和成肌细胞分化的工作提供试验依据。

miRNA是表观遗传学研究的重要内容之一，其通过作用于mRNA来抑制靶基因的表达[19-20]。胎儿肌肉的发育对肉牛出生后的表型会产生极为重要的影响，然而目前人们对miRNA在牛胎儿骨骼肌发育过程中的角色并不完全清楚[21]。通过对牛胎儿成肌细胞体外培养分化过程中差异表达miRNA的鉴定，能够更好的理解骨骼肌发育的机制。

miRNA广泛存在于各个物种，并且具有一定的保守性，这为验证试验得到的miRNA提供了一定的参考[22]。在鉴别出的差异表达miRNA中，有一些已经在牛或其它物种肌肉的相关研究中有过报道。miR-199a-5p可以通过靶向作用于WNT2，调节平滑肌细胞的增殖和分化，在平滑肌肥大和器官重塑上有潜在的应用价值[23]。Zuo等[24]对猪肌肉miRNA表达谱分析后发现，miR-143通过HDAC4-MEF2通路调控MYH7的表达，进而影响肌纤维的类型，miR-1可以影响肌球蛋白的含量、肌纤维的类型和肌肉性能。miR-26a在C2C12细胞系、小鼠和人的原代骨骼肌细胞成肌分化过程中表达量都呈上升趋势，这与本研究结果一致[25]。miR-26a通过作用于转录因子Smad1和Smad4，调控TGF-β/BMP信号通路，促进肌细胞分化，给乳鼠注射miR-26a的特异性拮抗物，能够抑制乳鼠骨骼肌的分化[25]。miR-148a在C2C12细胞分化过程中表达上升，其靶向作用于ROCK1基因从而促进肌原细胞分化[26]。在正常细胞内过表达miR-148a可以促进肌原细胞的分化，同时使细胞周期停滞。用干扰剂抑制miR-148a的表达时，C2C12分化被抑制，MHC和MyoG表达量显著下降[26]。

表4高表达的差异表达miRNAs

Table4ThedifferentiallyexpressedmiRNAswithhighexpressionlevel

微小RANmicroRNAP值P⁃value错误检出率FDRA5dTPM值A5d＿TPMB5dTPM值B5d＿TPMC5dTPM值C5d＿TPMA0dTPM值A0d＿TPMB0dTPM值B0d＿TPMC0dTPM值C0d＿TPMbta⁃miR⁃21⁃5p2．53E⁃050．0005362200321746082375771694996537828335bta⁃miR⁃199a⁃5p0．0025280．014098422853159143873335652326114721bta⁃miR⁃199a⁃3p1．11E⁃067．62E⁃0529100195672540910027101065590bta⁃miR⁃199c1．45E⁃067．89E⁃0529100195662540810027101065590bta⁃miR⁃1430．0026160．0142411743719049210721542676168483bta⁃let⁃7f0．0037960．018309106117158105541156339471730bta⁃miR⁃424⁃5p0．0007720．00600310161511312364849733431590bta⁃miR⁃3780．0091150．0343852814322144288859119297927bta⁃miR⁃1360．0016010．010163654679559555821532032077bta⁃miR⁃26a0．0019520．011807809849259584631442662158bta⁃miR⁃148a1．20E⁃067．62E⁃05118385151946343841151371bta⁃miR⁃199b0．0100430．03625524126794596420125561483bta⁃miR⁃2210．0052080．022808159011721739632235402819bta⁃miR⁃320a0．0054040．022992152614601442394448553695bta⁃miR⁃1520．0002920．00358336362844335031311174515bta⁃miR⁃10．0008940．006627145596363981827880189bta⁃miR⁃3810．0019040．01169813249513732177128685bta⁃miR⁃30a⁃5p0．000140．0020571499196122561560578168bta⁃miR⁃26b0．0030870．01625191972921951619623303bta⁃miR⁃30d0．0022930．0134391353131216751393752394

图5 差异表达miRNA预测靶基因的GO分析Fig.5 Gene Ontology analysis of predicted target genes for differentially expressed miRNAs

图6 差异表达miRNA预测靶基因的KEGG通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of predicted target genes for differentially expressed miRNAs

不同miRNAs表达量间相比，*. P<0.05,**. P<0.01*.P<0.05,**.P<0.01 among expression levels of miRNAs

图7 miRNA的测序及qPCR检测结果Fig.7 Expression of miRNAs quantified by sequencing and qPCR

KEGG通路分析表明，本研究筛选的差异表达miRNA的靶基因富集到了多个与肌肉发育相关的通路。如p38 MAPK信号通路是参与骨骼肌发育的重要调控通路。MAPK能够激活转录因子MyoD基因和MEF2家族成员的表达，促进成肌分化[27]。钙离子信号通路对骨骼肌的生成、稳态维持和再生至关重要，钙离子有可能对肌卫星细胞产生直接作用，控制其处于静止状态或是增殖分化成为不同功能的肌肉[28]。细胞炎性因子TNF-α能够通过作用于p38 MAPK抑制骨骼肌的分化[29]。用TNF-α处理人成肌细胞，细胞miRNA的表达受到了影响，进而影响到多个细胞进程，最终对肌管形成产生抑制作用[30]。IGF-1/Akt信号通路在骨骼肌生长过程中发挥着核心作用，能够促进蛋白质合成、增加肌肉量[31]。美国康乃狄克州的研究人员发现，瞬时电位通道(TRP channels)的增多促进了心肌的纤维化，钙离子通透型的瞬时电位通道可能成为治疗心肌纤维化的新靶点[32]。瞬时电位通道可能与心肌肥大和心律失常相关[33]。将C2C12细胞培养在极低频率磁场中，细胞的间隙连接增加，C2C12融合和分化的速度加快，可能为肌肉功能紊乱找到新的治疗方法[34]。

基于上述已有研究，可以看到测序结果中的部分miRNA对成肌细胞分化的影响已经被印证，但是肌肉发育是一个复杂的过程，涉及到非常复杂的基因表达调控网络的变化，所以miRNA在其中的作用机制还有很多待挖掘的地方。并且，miRNA在物种之间存在一定的差异，牛的物种特异性的调控机制也有待进一步研究。因此，本试验结果将为以后的相关研究提供重要的参考。

4 结 论

本研究通过高通量测序和生物信息学分析，鉴定出了150个在牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞分化过程中差异表达的miRNAs，这些miRNAs有可能参与了牛胎儿期骨骼肌的分化。靶基因预测和功能分析表明，差异表达miRNA可能在动物肌肉发育相关的细胞信号通路中起作用，为进一步研究miRNA调控家畜骨骼肌发育奠定理论基础。

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