原始热带雨林鹦歌岭土壤抗MRSA放线菌的分离与筛选

潘洁明 张荣意 邓加艾 谭志琼

（海南大学热带农林学院，海口 570228）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）耐药性强，能够引起致死性感染，危害性十分严重，已经成为临床抗菌感染治疗的首要难题，并与乙型肝炎、艾滋病一起被称为当今世界三大感染顽疾，给人类带来了极大危害［1-2］。自1961年英国Jevons发现首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA以来［3］，在欧美、亚洲等各地相继出现MRSA所致的感染，到20世纪80年代，有关MRSA的感染几乎遍及全球，成为临床上最常见的病原菌之一。MRSA本在医院重症监护室和外科手术室中泛滥，但据最近报道，其已从医院扩散到社区人群和食用动物之中［4-5］。自Saravolatz等［6］首次报道社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Community-acquired methicillinresistant Staphylococcus aureus，CA-MRSA）感染后，CA-MRSA感染病例在全球陆续被报道，MRSA已严重威胁人类的健康。

MRSA一般具有多重耐药特征，MRSA感染已引起世界范围的广泛关注，目前治疗MRSA感染的抗生素十分有限，仅有万古霉素和利奈唑胺［7］。但最近的研究结果表明，新的抗万古霉素和利奈唑胺的MRSA已经出现［8］。因此，面对MRSA耐药性的日趋严重，寻找和开发高效抑制MRSA的抗生素显得相当重要［9-10］。放线菌（Actinomycetes）是产生抗生素最多的一类微生物，目前世界上已经发现的抗生素80%是由放线菌产生的［11］。鹦歌岭位于海南省乐东县，海拔1 811 m，山高坡陡，交通闭塞，人烟稀少，绝大部分从未有过正规和大规模的开发利用，表现出非常明显的原始特征，生物多样性极其丰富［12］，目前对放线菌的研究未见报道。其中可能蕴藏着抗MRSA的丰富放线菌资源。本研究从鹦歌岭土壤中分离、筛选抗MRSA的放线菌，并对其进行初步鉴定和抗菌活性物质研究，目的是从中发现新的抗MRSA的放线菌及其活性物质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品土壤 本实验所用的土壤采自海南省乐东县原始热带雨林鹦歌岭。采样深度为20 cm，土壤表面覆盖茂盛的乔木（表1）。

1.1.2 供试菌株 MRSA ATCC 9551由海南省药监所提供。

1.1.3 培养基 高氏一号培养基用于分离培养土壤放线菌，牛肉膏蛋白胨培养基用于MRSA的培养和测定，高氏一号液体培养基用于菌株发酵［13］。

表1 土壤样品

1.2 方法

1.2.1 土壤中拮抗放线菌的分离与筛选 采用平板稀释法分离各土壤样本中的放线菌［14］。取浓度为10-3、10-4和10-5的土壤悬浮液200 μL加入至高氏一号培养基（加入70 μg/mL重铬酸钾来抑制细菌和真菌）上，并用无菌的涂布棒涂布均匀，贴好标签，28℃培养7-10 d。待长出放线菌菌落后，挑取不同类型的菌落在高氏一号试管斜面上保存。采用琼脂块法筛选抗MRSA的菌株：将斜面上的MRSA用无菌水制成悬浮液，并与45℃牛肉膏蛋白胨培养基充分混匀后倒平板，将高氏1号平板上已经培养好的放线菌打菌块（6 mm），然后挑取至含MRSA培养基上，28℃培养24-48 h，观察拮抗效果［15-16］。挑取拮抗性好的放线菌进行纯化，复筛，保存。

1.2.2 抗MRSA菌株发酵粗提物的制备 将筛选出的菌株接种到高氏一号固体培养基上，28℃培养8 d，取分生孢子制备孢子悬浮液，采用摇瓶发酵培养法，将悬浮液接种到装有100 mL高氏一号液体培养基的锥形瓶（100 mL/250 mL）中，于28℃、200 r/min摇瓶培养7 d，然后用8层灭菌纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，菌丝体用70%的乙醇浸泡48 h，减压浓缩后，用水溶解，再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压蒸馏浓缩可得到乙酸乙酯粗提物，用甲醇溶解，4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 粗提液对MRSA的抑菌作用 采用滤纸片法测定粗提液对MRSA的抑菌活性。将MRSA与牛肉膏蛋白胨培养基混合后倒平板，用移液枪分别吸取5 μL粗提液加到灭菌滤纸片（6 mm）上，将该加样的滤纸片放置到带MRSA的平板上，每个平皿3个重复，然后置于28℃培养箱内培养24-48 h，观察拮抗效果，同时用甲醇作对照。

1.2.4 抗MRSA菌株的16S rDNA序列测定及其系统发育分析 采用OMEGA公司细菌DNA提取试剂盒（D3350-01）提取菌株基因组DNA［17］。引物序列 如 下 ：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。 扩 增反应体系总体积为25 μL，其中包括Genomic DNA 1μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，PCR-Mixture 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR应条件：预变性，94℃，5 min；变性，94℃，30 s；退火，52℃，30 s；延伸，72℃，1 min；35个循环；终止延伸，72℃，10 min；4℃保存［18］。将PCR测序产物送上海生工生物工程技术服务公司测序，结果用BLAST软件比对，查找相似性最高的同源菌株，并利用Mega6.0［19］构建系统发育树。

1.2.5 HPLC指纹图谱的建立 用安捷伦高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260 Infinity HPLC）检测分析发酵液粗提物的指纹图谱，安捷伦DADG1315D检测器，色谱柱YMC-packed C 18（5 mm，250 mm× 4.6 mm）。在HPLC上以相同的条件进行梯度洗脱（1 mL/min，10%甲醇10 min，10%-100%甲醇，20min，100%甲醇5 min，总时间35 min）。

2 结果

2.1 拮抗放线菌的分离与筛选

从10份土壤样本中共分离到168株放线菌，其中10株具有较强的抗MRSA活性（表2）。由表2可知，放线菌菌块的抑菌直径在17-31 mm之间，抗MRSA能力强。根据《消毒技术规范》可知，抑菌效果主要有3个等级，抑菌直径在20 mm以上为抑菌效果强，在10-20 mm为抑菌效果中等，在10 mm以下为抑菌效果弱。由此可见，该10株放线菌中有4株为强抑菌菌株，6株为中等抑菌菌株。

液体发酵的乙酸乙酯粗提物对MRSA抑菌结果见表2。菌株7抑菌直径达到25 mm，抑菌能力强，表明产生了高活性的抗菌物质；菌株5抑菌直径为15 mm，抑菌能力仅次于菌株7；菌株8-1、8-4抑菌直径分别为10 mm和11 mm，抑菌能力中等，而菌株8-3、9-1、4-1、4-2、3-13和3-14抑菌直径小于10 mm，抑菌能力弱。由此可见，菌株7、菌株5值得进一步深入研究。

表2 放线菌对MRSA的抑菌效果

表3 抗MRSA放线菌分离菌株的分子鉴定

2.2 抗MRSA菌株的系统发育分析

获得10株具有抗MRSA菌株16S rDNA序列均在1 400 bp左右，其在NCBI进行BLAST分析，发现与这10株菌相似率最高的均为链霉菌（Streptomyces），均达到99%（表3），初步判断这10株放线菌均为链霉菌。用Mega 6.0中的N-J法构建系统发育树（图1），其中菌株9-1、8-4、8-1和4-2与Streptomyces lunalinharesii strain RCQ 1071T聚在一支，相似率98%；菌株7与Streptomyces yunnanensis strainT聚为一支，相似率84%；菌株8-3和菌株5与Streptomyces aureofaciens strain KACC 20180T聚为一支，相似率96%-99%；菌株3-13、3-14、4-1与Streptomyces lateritius strain LMG 19372T聚为一支，相似率95%。

图1 10株放线菌16S rDNA序列的系统发育树

2.3 抗MRSA菌株的HPLC指纹图谱

根据10株放线菌发酵液粗提物的HPLC指纹图谱（图2）发现，菌株7、菌株5和菌株9-1的主峰出峰时间主要集中在12-27 min，在220-340 nm波长处均有吸收。由图2可见，发酵液50%甲醇-水洗脱部分有明显的次级代物产物峰，显示3株菌代谢产物均丰富，但是3株菌株的代谢产物有区别。菌株7在21.6-23.6 min为系列化合物，紫外吸收主要在250 nm左右有强吸收峰；菌株5在23-26 min之间为系列化合物，从紫外吸收图谱上看，在250 nm，300 nm，440 nm有强吸收峰；菌株9-1在21-26 min有强吸收，从紫外吸收图谱看，有不同系列的化合物。3株菌株有不同类型的化合物，但3株菌对MRSA均有活性。菌株5的系列化合物最丰富，有可能是抗MRSA的主要成分，有利于构效关系的分析。

3 讨论

海南素有“天然大温室”的美称，温高少寒，蕴藏着极其丰富的放线菌资源，至今仍未被充分开发利用［20］。样品土壤来源于海南省乐东县鹦歌岭，该地处热带，气候适宜，微生物丰富。在海南有关放线菌的分离来源报道主要有霸王岭和红树林土壤［21-22］，而对于鹦歌岭土壤报道甚少，因此很有可能从这一土壤中得到新的抑菌活性化合物，从而研发出新型的抗MRSA药物。缪承杜［23］从海南文昌红树林保护区分离到608株真菌，其中7株具有较强的抗MRSA活性；宓伟等［24］发现黄连、黄柏、大黄、银柴胡与石榴皮5种中药具有较高的抗MRSA作用；唐依莉［25］从清澜港头苑村红树林保护区分离到138株内生放线菌，其中27株具有抗MRSA活性；高正航［26］从海南省霸王岭土壤共分离到287株放线菌，得到抗MRSA活性放线菌35株；黄惠琴［27］从海南、湛江和北海沿海地区采样分离获得放线菌395株，43株有抗MRSA活性。

图2 菌株7、5、9-1的紫外吸收图谱（从上到下依次为菌株7、5、9-1）

本研究通过平板稀释法分离获得放线菌168株，从中筛选到10株具有抗MRSA的活性菌株，并对筛选菌株进行16S rDNA序列测定、对比，初步确定该放线菌是链霉菌属；采用滤纸片法和高效液相色谱仪检测粗提液的活性物质，发现10株放线菌对MRSA的生长均有明显的抑制作用。HPLC指纹图谱显示菌株7、菌株5、菌株9-1的次级代谢产物十分丰富，且存在系列化合物，其丰富化合物的生物活性很有研究价值，为探寻新的抗MRSA药物提供依据。此外分离到的168株放线菌中，对MRSA有拮抗作用的放线菌就高达10株，说明鹦歌岭放线菌资源丰富。其特殊的原始森林环境可能会赋予其特殊的代谢途径，进而获得新颖的代谢产物。而且，鹦歌岭不同海拔高度，不同植被覆盖情况的土壤可能存在更多尚未发现和利用的抗MRSA放线菌，值得对其开展系统而全面的研究。下一步研究将对具有抗MRSA活性的放线菌的次级代谢产物进行分离纯化，寻找结构新颖的生物活性物质，探寻新的抗生素。

在研究中我们发现如3-14菌株，其琼脂块的抑菌活性很好，可液体发酵或固体发酵后，乙酸乙脂粗提物的抑菌活性却较弱，可能与乙酸乙酯只提取脂溶性活性成分有关。另外，本研究分离筛选的菌株经鉴定为链霉菌属，对MRSA有拮抗作用，但对农业病原菌的作用如何需要进一步研究。

4 结论

从10份鹦歌岭土壤中分离、筛选到10株具有抗MRSA活性的放线菌，经16S rDNA测序比对分析，10株均属于链霉菌属（Streptomyces）。7号菌抑菌效果最强，乙酸乙酯粗提物的抑菌圈直径高达25 mm，属强抑菌，其余9株的抑菌直径在8-15 mm，对MRSA有一定的抑制作用。HPLC指纹图谱显示，菌株7、菌株5、菌株9-1在220-340 nm均有吸收，330 nm上存在最大吸收峰，发酵液次级代谢产物丰富。

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