Ag+注入对TiO2纳米管抗菌和亲水性能的影响

孙婷婷，侯兴刚，李 静，李德军

（天津师范大学物理与材料科学学院，天津300387）

由于具有良好的生物相容性、与人骨接近的弹性模量、抗压和抗拉强度高等优良的物理性能，医用钛合金在牙科、骨科和血管支架等领域应用广泛[1-2].为使医用钛合金获得更好的生物相容性，其表面改性一直是研究的热点.目前，在医用钛合金表面形成TiO2纳米管（TNTs）结构是其表面改性的重要研究课题[3].与体材料相比，TiO2纳米管（TNTs）具有更大的比表面积，提高了表面负载量，有利于其作为体内药物可控释放的载体[4-7].为提高临床应用的安全性，TNTs需具备一定的抗菌性能，以抑制植入体表面的感染.因此，本研究采用具有良好抗菌性能的Ag+注入方法制备含银TiO2纳米管（Ag+-TNTs）.通过释放的Ag+与细菌直接作用，破坏细菌结构，从而达到抗菌目的.此外，释放到溶液中的Ag+还会生成·OH等具有强氧化性的自由基.这些活性自由基通过强氧化作用氧化细菌体内的辅酶A，破坏细菌的细胞壁和细胞膜，改变细胞壁和细胞膜的通透性，实现抗菌目的[7-9].为了有效结合Ag+的抗菌性能和TNTs纳米结构的优势，本研究采用离子注入法制备Ag+-TNTs，重点研究注入剂量对TNTs抗菌性能的影响.同时，为了研究Ag+对TNTs表面细胞生长的影响，通过表征TNTs表面的亲水性，分析注入对细胞生长可能的影响.

1 实验

1.1 样品制备

1.1.1 Ag+注入

将纯度高于99.7%的Ti片（1 cm×4 cm，d=2.5 mm）用细砂纸打磨，分别用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗5 min，取出后置于60℃烘箱烘干备用.以Ag作为阴极，利用MEVVA源离子注入机对Ti片进行离子注入，加速电压为60 kV，注入基底Ti片的Ag+注入剂量分别为 5×1016、1×1017和 5×1017ions/cm2.

1.1.2 Ag+-TNTS制备

以Ag+注入后的Ti片为阳极，相同大小的Pt片为阴极，保持两电极相互平行，在电极间距为3 cm、电压为50 V的直流恒压条件下，置于电解液中.电解液由1.66 g质量分数为0.6%的氢氟酸、270 mL质量分数为99.7%的乙二醇和30 mL去离子水组成，进行阳极氧化2 h，最后将所得样品在450℃的高温下烧结4 h，得到Ag+注入TNTs.

1.2 样品测试

1.2.1 样品表征

采用日本日立公司的SU8100型扫描电子显微镜（SEM）对样品的表面形貌进行表征，采用D/MAX-2500型 X 线衍射仪（XRD，Cu（40 kV），20 mA）对样品的微观结构进行表征；利用X线光电子能谱（XPS，PHI5000VersaProbe，Ulvac-Phi，Japan）对材料的表面成分进行分析.采用JC2000型接触角测试仪测量水滴与Ag+-TNTs、TNTs和纯Ti片表面的接触角，表征其亲水性能，每次用仪器针管滴去离子水5 μL，为减小测量误差，每个样品在薄膜表面的5个不同位置测量接触角值，最后取平均值[10].

1.2.2 抗菌实验

①吸取大肠杆菌E.coli（革兰氏阴性）菌液10 μL滴入4mL的LB液体培养基中（不含抗生素，pH=7.0），在37℃恒温培养箱中培养12 h；②利用分光光度计测试细菌悬浊液的OD值，用磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7）梯度稀释上述大肠杆菌菌液，将细菌分散成单个细菌，使大肠杆菌溶液初始浓度为5×104CFU/mL，其中PBS溶液由1 000 mL的H2O溶解8.5 g的NaCl、2.2 g的Na2HPO4以及0.2 g的NaH2PO4配制而成；③将无菌纯Ti片作为对照组，Ag+-TNTs和TNTs样品作为实验组，标号后放入无菌24孔板的各个孔中，将1 mL菌液用移液枪注入到孔中，将24孔板放入37℃、转速为210 r/min的摇床中恒温培养24 h，利用平板计数法测得大肠杆菌菌落数，计算不同材料的抗菌效率；④在空白孔中注入1 mL菌液作为对照组，重复上述步骤，以上实验均在无菌条件下进行.

2 结果与分析

2.1 结构表征与元素分析

图1为不同Ag+注入计量样品的SEM形貌图.

图1 不同Ag+注入剂量的TNTs的SEM图Fig.1 SEM images of Ag+implanted TiO2nanotubes with different dose

由图1（a）可以观察到，未注入Ag+的TNTs絮状物较多，坍塌腐蚀比较严重，注入Ag+的TNTs比较整齐，说明Ag+注入可以有效缓解坍塌现象.随着Ag+注入剂量的增加，TNTs的形貌更加整齐，结构更加有序，致密性增加.当Ag+注入剂量为5×1017ions/cm2时，纳米管间毫无粘连且朝向一致有序，纳米管和基底间结合牢固不脱落.相比未注入Ag+的情况，Ag+-TNTs具有更强的吸附能力和更大的比表面积，有利于提高TNTs的表面负载量[11-12].TNTs孔隙率的提高有利于表面吸附更多的水分子和氧，从而生成更多的羟基，提高TNTs表面的亲水性.

图2为不同Ag+注入剂量下TNTs阵列样品的XRD图谱.由图2可以看出，TNTs经过高温退火后出现锐钛矿相衍射峰，TNTs和所有Ag+-TNTs均在2θ=25.31°处出现了TiO2锐钛矿相的衍射峰，对应（101）晶面，是TiO2锐钛矿相热力学上最稳定的晶面[12-13].此外，TiO2纳米管还出现了TiO2锐钛矿相的（103）和（200）晶面，分别对应 36.95°和 48.04°处.在 Ag+-TNTs中，未发现Ag的衍射峰，即没有产生新相.但随着Ag-注入剂量的增加，锐钛矿相（101）晶面的峰值逐渐减弱，各衍射峰变得尖锐，说明Ag+注入剂量增大有利于TNTs结晶性的增强.

图2 不同Ag+注入剂量TNTs的XRD图Fig.2 XRD patterns of Ag+implanted TiO2nanotubes with different dose

Ag+注入剂量为1×1017ions/cm2的Ag+-TNTS的Ag 3d的XPS图谱如图3所示.

图3 Ag+注入 TNTs的 XPS图Fig.3 Ag 3d XPS spectra of Ag+implanted TiO2nanotubes

由图3可以看出，Ag 3d5/2结合能的峰值出现在367.8 eV处，经高斯拟合后，在结合能为366.8、367.8和369eV处出现了3个峰值，分别对应Ag2+、Ag+、Ag0[14-15]，且Ag+峰强最强，表明注入的Ag主要以Ag+形式存在.Ag+是Ag实现抗菌功能的主要释放形式，因此离子注入后，样品表面存在大量Ag+有利于提高Ag+-TNTS的抗菌能力.

2.2 亲水性能

图4为自然光照射下测量不同Ag+注入剂量TNTs表面接触角时水滴的铺展图.由图4可以看出，样品的接触角分别为 37.6 °、33.7 °、28.2 °、13.2 °和 11.0 °，水滴在TNTs表面的接触角小于Ti片，说明纳米管的亲水性优于纯Ti表面的氧化层.原因主要有2点：一方面是TiO2纳米管有较高的活性比表面和大量的表面缺陷，表面积的增加提高了水分子与材料的接触机会；另一方面纯Ti片经阳极氧化生成TiO2纳米管后，也产成了少量的亲水性基团，此外，阳极氧化的表面处理方法可以提高纯Ti的表面自由能.而随着Ag+注入后，水滴在TNTs表面的接触角明显减小，且随着Ag+注入剂量的增加，接触角减小.当Ag+注入剂量为5×1017ions/cm2时，纳米管的亲水角减小到最小.这表明适量注入Ag+有助于在TNTs表面产生肖特基势垒，促进光生载流子的分离，从而使Ag+-TNTs具有极高的亲水性能[16-17].研究表明，生物材料表面亲水性的提高有利于细胞的生长，因此Ag+注入有利于细胞在TNTs表面的生长.此外，含银材料的抗菌模式之一为直接接触抗菌，因此Ag+注入TNTs表面也有利于细菌的吸附，相应提高TNTs的抗菌性能.

图4 样品表面水滴图像Fig.4 Images of water droplet on the surface of the samples

2.3 抗菌性能

不同Ag+注入剂量的TNTs与大肠杆菌作用后的菌落照片如图5所示.由图5可以看出，空白组样品和未注Ag+的TNTs表面存在大量菌落分布，注入Ag+的TNTs样品的菌落存活量均有明显减少，说明注入Ag+的TNTs均具有一定的抗菌效果.从图5中可以清晰地看出，随着Ag+注入剂量的增大，Ag+-TNTs的抗菌能力有所增强，均明显优于TNTs.而当Ag+注入剂量为5×1017ions/cm2时，Ag+-TNTs表面几乎没有细菌菌落，说明此时纳米管的抗菌效果最好.

用体视显微镜观察并用数码相机记录注Ag+与未注入Ag+样品的菌落数，按下式计算样品的抗菌率.

式（1）中：A和B对应相同面积内，自然生长下培养皿中的菌落数和不同Ag+注入剂量Ag+-TNTs与细菌作用后培养皿中的菌落数.

图5 不同Ag+注入剂量的TNTS对大肠杆菌存活率影响Fig.5 E.coli survival of Ag+implanted TiO2nanotubes with different dose

统计各样品培养皿中固定面积的菌落数，通过式（1）计算得到抗菌率分别为2.7%、7.8%、50.6%、86.0%和94.9%.通过计算抗菌率可以直观看出，Ag+-TNTs样品具有明显的抗菌效果，且抗菌效率随着Ag+注入剂量的增大而增大.由此推断当注入剂量高于5×1017ions/cm2时，Ag+-TNTs对大肠杆菌的抗菌率接近100%.光照条件下，TiO2材料能生成大量氧化能力很强的羟基自由基，因此TiO2材料具备抗菌性.本研究中抗菌实验在避光条件下进行，因此TNTs只表现出了微弱的抗菌性，Ag+-TNTs的抗菌性几乎完全由注入的Ag+产生.TNTs中Ag以离子形式存在，且管状结构增加了其与菌液的接触面积，有利于更多的Ag+析出到菌液中.析出的Ag+与细菌中蛋白酶上的巯基（—SH）结合，使蛋白酶失去活性，导致细菌死亡[18-20].由以上分析可知，Ag+-TNTs抗菌效率与菌液中Ag+浓度有关，浓度越高抗菌效率越高，因此Ag+注入剂量最高的TNTs表现出了最高的抗菌性.

3 结论

通过Ag+注入纯Ti片基底和阳极氧化法制备一系列不同注入剂量的Ag+-TNTs.利用SEM、XRD和XPS对TNTs和Ag+-TNTs的表面形貌、微观结构和成分进行表征，利用抗菌率和水接触角分别表征TNTs和Ag+-TNTs的杀菌性能和亲水性能.研究结果表明：

（1）离子注入掺杂技术可以明显改变TNTs的表面结构，改善TNTs的表面形貌和结晶性.

（2）与TNTs相比，不同Ag+注入剂量Ag+-TNTs的亲水性均得到改善，且随着Ag+注入剂量的增加，亲水性不断提高.材料表面的亲水性越高，表面自由能就越低，可以抑制微生物粘附，防止形成微生物膜.

（3）TNTs对大肠杆菌几乎没有抗菌作用，而注入Ag+后，Ag+-TNTs表现出优良的抗大肠杆菌能力，且随着Ag+注入剂量的增大，抗菌效果越明显，说明Ag+注入可以有效提高TNTs的抗菌性能.

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