水溶性辅酶Q10对鱼藤酮致PC12细胞凋亡的保护作用及其机制

江毓敏，李海宁，林邵青，陈燕燕，安 静，马春换，宦楠楠，成 江

(1. 宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川 750004；2. 宁夏医科大学总医院神经内科，宁夏银川 750003)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)，又名震颤麻痹(paralysis agitans)，是一种常见于老年人的神经系统变性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征。遗传与环境的共同作用在PD的发病中起了重要作用，其主要病理改变是黑质多巴胺能神经元变性。尽管其具体发病机制至今尚未明确，但一系列的研究显示，PD的发病主要与细胞凋亡途径被激活、氧化应激及线粒体功能障碍等有关[1-2]。辅酶Q10(Coenzyme Q10, CoQ10)在线粒体呼吸链中作为移动电子转运和辅助因子的解偶联蛋白，是人体内强大的抗氧化剂，能够防止自由基的氧化损伤，包括线粒体膜内脂质的氧化。有学者认为PD的发生可能与CoQ10的减少有关[3-4]。但传统的CoQ10为脂溶性，生物利用度较低，难以被人体吸收利用，新近研发出的水溶性CoQ10细胞摄取度和线粒体摄取度分别是传统CoQ10的60倍和20倍[5]。鱼藤酮(rotenone, Rot)是生活中常见的杀虫剂，其作用方式与亲帕金森毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)相同，可特异性抑制细胞呼吸链的NADH脱氢酶(线粒体复合物I，complex I)[6]。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pheochromocytoma cell, PC12)株的性质及细胞内含有的酶类、合成的递质等都与中脑多巴胺神经元相似[7-8]，因此，本课题组以PC12细胞作为多巴胺能神经元的细胞模型，研究水溶性CoQ10对神经元凋亡的抑制作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂DMEM高糖培养基、胎牛血清(fetal bovine serum)、PBS磷酸盐缓冲液购于Hyclone公司；青链霉素、胰蛋白酶(trypsin)购于索莱宝公司；Rot、高纯度(>98%)CoQ10、聚氧乙基-α-生育酚癸二酸酯(polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate, PTS)购于Sigma公司；活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；凋亡诱导因子(anti-apoptosis-inducing factor antibody, anti-AIF antibody)、anti-active Caspase3 antibody、anti-Caspase9 antibody、anti-beta actin antibody(anti-β-actin antibody)、Anti-Lamin B1 antibody、Goat Anti-rabbit antibody购于美国Abcam公司；浆蛋白核蛋白提取试剂盒购于凯基生物技术有限公司。

1.2细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞(已经由神经生长因子诱导分化)，购于上海生命科学院。

1.3主要仪器二氧化碳(CO2)培养箱(美国Forma Scientific公司)；普通倒置显微镜(Olympus CKX41，日本Olympus公司)；带摄像功能荧光显微镜(Nikon eclipse，日本Nikon公司)；荧光分光光度计(Olympus，日本Olympus公司)；流式细胞仪(日本Olympus公司)；多波长酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4方法

1.4.1试剂准备 将Rot溶解于DMSO中，制成储存液，备用；将PTS与CoQ10按照2∶1摩尔比例在50 ℃下混匀，制成水溶性CoQ10[9]。

1.4.2细胞培养 将PC12细胞置于含100 mL/L胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖培养基，50 mL/L CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中孵育，24 h换液，待细胞融合至80%左右时用于以下实验。

1.4.3Rot建立PD模型 将对数生长期细胞接种到96孔板，于37 ℃孵育箱过夜，用不同浓度Rot(0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L)作用24 h，同时设置空白对照(control)组、溶剂对照(vehicle)组(1 mL/L DMSO)，使用CCK8检测细胞存活率，并在倒置显微镜下观察细胞形态，选择细胞存活率50%左右的Rot浓度建立PD模型，进行以下实验。

1.4.4水溶性CoQ10对正常细胞以及PD模型细胞存活率的影响 将对数生长期细胞接种到96孔板，于37 ℃孵育箱过夜，用不同浓度水溶性CoQ10(25、50、100 μmol/L)对细胞预处理3 h后加入鱼藤酮处理24 h，CCK8检测细胞存活率，并在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.5实验分组 将细胞分为vehicle组(加入1 mL/L的DMSO)、Rot组(1 μmol/L Rot)、CoQ10组(50 μmol/L CoQ10)、CoQ10治疗组(1 μmol/L Rot+50 μmol/L CoQ10)。

1.4.6细胞内ROS检测 使用南京建成ROS检测试剂盒进行检测。收集vehicle组、Rot组、CoQ10组、CoQ10治疗组和阳性对照组(Rosup，50 mg/L，试剂盒提供)的细胞各1×106个，重悬于含10 μmol/L 2′，7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)的PBS中，CO2孵箱内孵育30 min，PBS洗涤3次，用PBS重悬细胞，调整细胞密度，使各组细胞浓度一致。阳性对照组按照试剂盒要求，使用终质量浓度50 mg/L的Rosup，作用时间30 min，荧光分光光度计检测荧光强度，激发光波长为488 nm，发射波长为525 nm，以各处理组/对照组的比值作为ROS的数值。

1.4.7Western blot检测CoQ10对凋亡信号蛋白AIF、Bcl-2、Bax、Caspase-9及active Caspase-3表达的影响 收集处理好的细胞，按照试剂盒要求提取浆蛋白与核蛋白(凯基核蛋白浆蛋白提取试剂盒)，Bradford法测定蛋白含量，SDS-PAGE电泳分离并将蛋白转移到PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min，50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h。以LaminB1作为AIF的内参，β-actin作为Bcl-2、Bax、Caspase-9、active Casepase-3的内参，4 ℃孵育(AIF、Bcl-2、Bax、Caspase-9、active Casepase-3、β-actin及LaminB1的稀释浓度均为1∶2 000)过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(均使用Goat Anti-rabbit antibody)室温孵育2 h，显影，凝胶成像仪照相并分析蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1不同浓度Rot对PC12细胞存活率的影响本实验采用梯度浓度Rot处理细胞24 h，细胞存活率如图1。单因素方差分析显示，不同浓度Rot细胞存活率具有统计学差异(P<0.01)，且细胞存活率与Rot浓度呈负相关，Rot浓度越高，细胞存活率越低。倒置显微镜下观察细胞形态，正常对照组和溶剂对照组细胞突起明显、呈梭形，给予不同浓度的Rot处理后，细胞大部分胞体皱缩，突起缩短甚至消失，细胞呈类似圆形，且数量减少。在Rot浓度为1 μmol/L时，细胞存活率约为50%，后续实验将采用1 μmol/L的Rot建立细胞模型。control组与vehicle组差异无统计学意义(P>0.05)，可忽略DMSO对细胞的影响。

图1 不同浓度Rot对PC12细胞存活率的影响Fig.1 Effects of Rot of different concentration on survival rate of PC12 cells

2.2水溶性CoQ10对Rot致PC12细胞形态及存活率的影响选用25、50、100 μmol/L CoQ10对模型组PC12细胞进行治疗，结果显示，与Rot组比，50、100 μmol/L CoQ10均可提高Rot组细胞存活率(P<0.05)，但是50 μmol/L与100 μmol/L的CoQ10对PC12细胞存活率改变无明显差异(图2)。因此，后续实验将选择50 μmol/L CoQ10作为治疗浓度。

图2 CoQ10对Rot致PC12细胞形态及存活率的影响Fig.2 Effects of CoQ10 on morphology and survival rate of PC12 cells

2.3细胞内ROS水平检测如图3所示，模型组Rot处理细胞24 h后荧光强度明显增强，提示细胞内ROS水平升高；治疗组CoQ10预处理3 h后荧光强度减弱，提示细胞内ROS水平降低(P<0.01)，CoQ10组荧光强度与vehicle组相比稍有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4水溶性CoQ10对凋亡诱导蛋白AIF及凋亡信号蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、active-Caspase-3表达的影响Rot处理24 h，PC12细胞核内AIF表达升高显著，凋亡信号蛋白的表达也发生明显改变，主要表现为Bcl-2表达降低(P<0.01)，Bax、Caspase-9表达增多(P<0.01)，active-Caspase-3表达也显著增多(P<0.05)。水溶性CoQ10可逆转上述凋亡信号蛋白的表达(图4)。

图3 细胞内活性氧水平的测定Fig.3 Determination of active oxygen level in cells

3 讨 论

PD的发病机制目前仍存在争议，线粒体功能障碍、氧化应激及细胞凋亡都是引起PD的重要原因[10-11]。线粒体是细胞内能量产生的重要细胞器，在能量代谢及细胞凋亡的调控中发挥关键作用，其能量的产生依赖于由5个酶复合体(复合体Ⅰ～Ⅴ)组成的线粒体呼吸链的电子传递，线粒体呼吸链不仅能够产生能量，还是体内自由基产生的主要场所，其任何部位受到损伤都会导致自由基生成增多。复合体Ⅰ(NADH-CoQ还原酶)是最大的一个，也是最易受损伤的一个。CoQ10是复合体Ⅰ的重要组成部分，是Ⅰ/Ⅱ的电子受体，同时还是重要的天然抗氧化剂，能够清除自由基，促进线粒体生成ATP。Rot作为生活中常见的杀虫剂，是线粒体复合体Ⅰ的选择性抑制剂，可抑制线粒体呼吸链生成ATP，从而导致氧化应激。氧化应激是黑质多巴胺能神经元选择性损伤的重要因素，它能启动环境因素诱发PD，同时可在细胞其他因素参与下得以不断加强。本研究观察到PC12细胞经过Rot处理24 h后细胞内ROS含量显著增多，给予CoQ10治疗后细胞内ROS水平降低，提示CoQ10可以降低Rot诱导的ROS水平升高，表明CoQ10可通过清除胞质中过多的氧自由基发挥神经保护作用。

图4 CoQ10对AIF、Bcl-2、Bax、Caspase-9及active Caspase-3表达的影响Fig.4 Effects of CoQ10 on AIF，Bcl-2，Bax，Caspase-9 and active Caspase-3 expressions

本研究发现，Rot对PC12细胞具有明显的细胞毒性，随着Rot浓度升高，细胞损伤越明显，突触明显缩短甚至消失，细胞存活率也降低，CoQ10可以改善Rot导致的PC12细胞损伤和凋亡。PD是病理性细胞凋亡所导致的一系列病理过程，内源性及外源性途径均能诱发细胞凋亡，现在发现至少有3条通路参与细胞调亡的发生，即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路，其中以线粒体通路最为经典[12-13]。位于线粒体膜上的Bcl-2蛋白家族在调节细胞凋亡中发挥至关重要的作用，Bcl-2蛋白家族分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，前者包括Bcl-2、Bcl-xl等，后者包括Bax、Bad等。有研究表明，Bcl-2可通过抵抗细胞内ROS的毒性阻止神经细胞凋亡[14]。Bcl-2/Bax表达比率的升高可使细胞免于凋亡。Caspase-3是细胞凋亡的执行蛋白，包括无活性的前体procaspase-3和活化的active Caspase-3，在正常细胞中含量很低。生理状态下，AIF存在于线粒体内外膜之间，是线粒体氧化还原酶，当受到凋亡刺激后，将会在通过核定位序列转移到细胞核内，引起染色体的凝集和DNA的损伤，启动不依赖于Caspase的细胞凋亡[15-16]。本实验发现，Rot处理后的PC12细胞Bcl-2/Bax的表达比率下调，原本低表达的active Caspase-3也大量表达。CoQ10可使Bcl-2/Bax的表达比率升高，即上调Bcl-2，下调Bax，同时降低active Caspase-3的表达。

综上所述，水溶性CoQ10对Rot致PC12细胞凋亡具有保护作用，其机制可能是通过清除细胞内氧自由基改善细胞氧化应激状态，以及上调Bcl-2、下调Bax，同时降低active Caspase-3及Caspase-9的表达来实现的。

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