抗旱和耐盐碱转基因棉花对土壤线虫群落的影响

郭佳惠， 李 刚， 赵建宁， 杨殿林， 闫凤鸣， 修伟明①

(1.农业部环境保护科研监测所， 天津 300191； 2.河南农业大学植物保护学院， 河南 郑州 450002)

土壤是农业生态系统中物质与能量交换的枢纽,土壤生物在土壤物质能量迁移转化过程中具有特殊的功能和作用。土壤线虫在土壤中分布广泛,以土壤中的细菌、真菌、其他线虫及植物组织为食,有分解有机物、养分,维持土壤生态平衡等重要作用,对土壤生态环境的变化极为敏感。土壤线虫作为土壤生态系统的重要成员,已成为指示土壤生态环境变化的指示生物[1]。

转基因育种是一种新型育种方式,具有周期短、效率高等特点,已成为作物育种界最重要的技术。自从1996年转基因作物首次商品化以来,截至2015年,全球转基因作物的种植面积已达1.797亿hm2,比1996年增加100多倍[2]。随着人口数量的增多,耕地面积的不断减少,为提高土地利用率,应对工业生产对棉花质量的要求、棉花种植技术的变革和种植区域的转移问题,通过生物技术培育抗旱、耐盐碱、抗病、抗除草剂、新型抗虫、优质高产等新性状棉花品种已成为新需求。自2008年以来,在转基因新品种保护项目的大力支持下,国内涌现出一批新型转基因棉花新材料[3]。转基因作物的大面积种植可能会对自然和农业生态系统产生负面影响[4]。转基因作物对土壤非靶标生物的负面影响便是其中一个重要的潜在风险。有关转基因作物对非靶标生物土壤线虫影响的研究已有大量报道,但结果却不尽相同。多数研究结果表明转基因作物对土壤线虫多样性无影响[5-8]。但也有研究指出,种植转基因作物会对土壤线虫个别指标及属种产生影响[9-11]。以往有关转基因作物对土壤线虫群落影响的研究多集中于转Bt基因抗虫作物[12-13]。由于干旱、盐碱等性状属于多基因控制的原因,所以提高作物抗逆水平一直是转基因研究领域的重点和难点,抗旱、耐盐碱等新性状转基因作物研发较晚且多尚处于研发阶段,继而对土壤线虫群落影响的研究也相对较少。因此,为评价抗逆转基因棉对棉田土壤生态环境的安全性,笔者通过试验研究了抗旱、耐盐碱2种性状抗逆转基因棉花对棉田土壤线虫群落的影响,以期为抗逆转基因棉花的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与样地设置

试验地位于天津市武清区的中国农业科学院武清转基因生物农田生态系统影响野外科学观测试验站(39°21′50″ N,117°12′53″ E)。该区域海拔为6.3 m,地处华北平原东北部,属暖温带湿润气候区。土壤类型属潮土,土壤全氮含量为0.56 g·kg-1,全磷含量为0.66 g·kg-1,有机质含量为11.42 g·kg-1。

1.2 供试材料与样地设置

抗旱转基因棉花品系013011及其受体对照棉花品系TH2、耐盐碱转基因棉花品系013018及其受体对照棉花品系Q,均由中国农业科学院棉花研究所提供。试验采用随机区组设计,每个棉花品种设3个重复,共12个小区,每个小区规格均为10 m×10 m,小区间均设10 m宽普通玉米隔离带。棉花全生育期采用常规耕作管理,不喷施杀虫剂。试验地周围设100 m宽普通玉米隔离带。

1.3 样品采集

分别于2014和2015年棉花苗期、蕾期、花铃期、吐絮期和衰老期采样。采样时,去除地表杂草和枯枝落叶,分别在各小区随机选取5株棉花,用土壤采样器紧贴棉花主茎采集0～10 cm表土,混匀后置于冰盒中带回实验室,剔除土样中根系及有机残体后分离土壤线虫。

1.4 土壤线虫的分离与鉴定

采用Baermann浅盘法分离线虫[11]:称取50.0 g鲜土置于Baermann浅盘中的滤纸上,23 ℃条件下分离48 h,然后过30 μm孔径钢筛收集线虫,并于60 ℃条件下热杀死后保存在40 g·L-1福尔马林溶液中。

用显微镜对线虫进行计数,将获得数据根据质量比例换算为100 g干土中线虫数量,质量比例为总线虫数与烘干后土壤质量比值的100倍。随机选择100条线虫,根据线虫形态分类鉴定法进行分类鉴定[14],如果线虫总数不足100条,则需全部鉴定。

1.5 数据处理与分析

1.5.1线虫群落生态指数的计算

将所鉴定的线虫按食性分为食细菌线虫(Ba)、食真菌线虫(Fu)、捕食杂食性线虫(OP)和植食性线虫(PP)[15],并计算其生态指数。成熟度指数(IM)计算公式:IM=∑vi×fi。其中,vi为自由生活的线虫属i的c-p值;fi为该线虫属i的比例[16]。植食性线虫指数(IPP)计算公式[16]:IPP=∑vj×fj。其中,vj为植食性线虫属j的c-p值;fj为该线虫属j的比例[16]。线虫通路指数(RNC)计算公式:RNC=B/(B+F)。其中,B为食细菌线虫数量;F为食真菌线虫数量[16]。Wasilewska指数(IW)计算公式:IW=(B+F)/P。其中,P为植食性线虫数量[17]。

1.5.2统计分析

所有线虫数量均转化为100 g干土中的数量,并计算每个线虫属的相对丰度和优势度。所有数据采用Excel 2010和SPSS 16.0软件处理,用单因素分析方法对各指标进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理棉田土壤线虫营养类群的丰度变化

在2014—2015年所采集土壤样品中,共鉴定出土壤线虫34属,其中,食细菌线虫13属,食真菌线虫3属,捕食性线虫9属,植食性线虫9属(表1)。

表1抗旱和耐盐碱转基因棉及其受体棉棉田土壤线虫组成和相对丰度

Table1Compositionandrelativeabundanceofsoilnematodesinthesoilsundertransgeniccottonsandtheircorrespondingnon-transgenicone

属营养类群c-p013011TH2013018Q相对丰度/%分级相对丰度/%分级相对丰度/%分级相对丰度/%分级 拟丽突属(Acrobeloides)Ba23.0±0.6++2.8±0.4++4.5±0.8++5.2±0.8++ 无咽属(Alaimus)Ba43.2±0.7++3.5±0.6++3.4±1.0++3.1±0.7++ 丽突属(Acrobeles)Ba20.7±0.2+0.4±0.2+1.4±0.4++0.7±0.2+ 头叶属(Cephalobus)Ba223.3±2.6+++24.8±3.2+++21.8±3.0+++22.7±2.4+++ 鹿角唇属(Cervidellus)Ba21.5±0.3++1.2±0.4++3.1±0.7++1.6±0.4++ 板唇属(Chiloplacus)Ba20—0—0.2±0.1+0.2±0.1+ 真头叶属(Eucephalobus)Ba220.2±2.3+++16.3±1.9+++17.3±2.2+++17.2±2.6+++ 中杆属(Mesorhabditis)Ba11.0±0.3a+0.4±0.1b+2.0±0.7++1.5±0.6++ 单宫属(Monhystera)Ba10—0—0—0— 盆咽属(Panagrolaimus)Ba17.4±1.3++4.7±0.7++6.2±0.7++6.0±0.7++ 棱咽属(Prismatolainus)Ba30.1±0.1+0.1±0.1+0.5±0.2+0.3±0.1+ 原杆属(Protorhabditis)Ba14.9±1.4++3.4±0.9++5.9±1.5++6.4±1.2++ 小杆属(Rhabditis)Ba20—0.1±0.1+0.8±0.5+0.2±0.1+ 真滑刃属(Aphelenchus)Fu21.4±0.5++1.5±0.5++0.7±0.2+0.7±0.2+ 短矛属(Doryllium)Fu40.3±0.1+0.2±0.1+0.5±0.3+0.1±0.1+ 茎属(Ditylenchus)Fu22.8±0.8++2.3±0.6++2.4±0.7++2.0±0.4++ 孔咽属(Aporcelaimus)OP50.2±0.1+1.0±0.3+0.7±0.3+1.2±0.6++ 真矛线属(Eudorylaimus)OP40.7±0.3+2.3±1.2++0.7±0.2+1.8±0.6++ 中矛线属(Mesodorylaimus)OP50—0—0—0— 微矛线(Microdorylaimus)OP40—0—0.5±0.3+0.1±0.1+ 拟矛线(Dorylaimoides)OP40—0.2±0.2+0.2±0.1+0.3±0.1+ 锉齿属(Mylonchulus)OP40.1±0.1+0.2±0.1+0.1±0.1+0.1±0.1+ 拟桑尼属(Thorneella)OP40.1±0.1+0—0—0— 盘咽属(Discolaimus)OP50.5±0.2+0.5±0.3+0.4±0.2+0.7±0.3+ 桑尼属(Thornia)OP40.1±0.1A+0.2±0.1B+0.3±0.2+0.3±0.1+ 丝尾垫刃属(Filenchus)PP20—0—0.1±0.1+0— 螺旋属(Helicotylenchus)PP324.5±3.7+++28.7±4.2+++20.7±2.7+++22.8±3.1+++ 短体属(Pratylenchus)PP30.2±0.1+0—0.2±0.1+0.2±0.1+ 矮化属(Tylenchorhynchus)PP30.7±0.2+0.4±0.2+0.9±0.4+1.0±0.3+ 垫刃属(Tylenchus)PP30—0.3±0.2+0.3±0.1+0.7±0.3+ 散香属(Beleodorus)PP21.7±0.5++1.5±0.5++2.8±0.7++1.8±0.4++ 裸矛属(Psilenchus)PP30.2±0.1+0.2±0.1+0.8±0.4+0.9±0.3+ 伪垫刃属(Nothotylenchus)PP20—0—0—0— 滑刃属(Aphelenchoides)PP22.0±0.7++3.0±0.7++1.8±0.4++1.7±0.6++

数据为平均值±标准误。Ba为食细菌线虫,Fu为食真菌线虫,OP为捕食杂食性线虫,PP为植食性线虫。+++指相对丰度>10%,优势属; ++指相对丰度介于1%～10%之间,普通属; +指相对丰度<1%,稀有属。“—”表示无数据。同一行英文小写字母不同表示在α=0.05水平上差异显著,英文大写字母不同表示在α=0.01水平上差异显著(F检验)。

抗旱转基因棉013011棉田土壤样品中鉴定出线虫25属,对照棉TH2棉田土壤样品中鉴定出线虫26属。耐盐碱转基因棉013018棉田土壤样品中鉴定出线虫30属,对照棉Q棉田土壤样品中鉴定出线虫29属。在所有处理棉田中均为优势属的有:头叶属(Cephalobus)相对丰度(100 g干土中某属线虫总数占总线虫数的比例)分别为23.3%、24.8%、21.8%和22.7%,真头叶属(Eucephalobus)相对丰度分别为20.2%、16.3%、17.3%和17.2%,螺旋属(Helicotylenchus)相对丰度分别为24.5%、28.7%、20.7%和22.8%。抗旱转基因棉013011棉田土壤中杆属(Mesorhabditis)线虫相对丰度显著高于其对照受体棉TH2(P<0.05),抗旱转基因棉田013011棉田土壤桑尼属(Thornia)相对丰度显著低于其对照受体棉TH2(P<0.01)(表1)。

由表2可知,在2014—2015年间,抗旱转基因棉013011与对照棉TH2棉田土壤线虫总丰度(丰度为100 g干土中线虫数量),食真菌线虫、捕食杂食性线虫、植食性线虫丰度均无显著差异,但抗旱转基因棉013011棉田土壤食细菌线虫丰度显著高于其受体对照棉(P<0.05)。耐盐碱转基因棉013018与对照棉Q棉田土壤线虫总数及食细菌线虫、食真菌线虫、捕食杂食性线虫和植食性线虫的丰度无显著差异。

方差分析结果表明,抗旱转基因棉013011和对照棉TH2棉田土壤线虫总数和各营养类型线虫不受采样时间的影响,采样时间和性状间也没有交互作用(表3)。但耐盐碱转基因棉013018与对照棉Q棉田土壤线虫总数及食细菌线虫、捕食杂食性线虫丰度在不同采样时间之间均存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01),而采样时间和性状间没有交互作用(表3)。

表2转基因棉与对照棉棉田土壤不同食性线虫的丰度

Table2Abundancesofdifferenttrophicgroupsofsoilnematodesinsoilsundertransgeniccottonandtheircorrespondingnon-transgenicone

转基因棉与其对照相比,同列英文小写字母相同表示两者间某指标在α=0.05水平上无显著差异(F检验),不同表示存在显著差异。

表3性状及采样时间对棉田土壤线虫丰度的方差分析

Table3Varianceanalysisofabundancesofsoilnematodesincottonfieldsrelativetocottontraitandsamplingtime

*和**分别表示在α=0.05和0.01水平上存在显著差异。

2.2 不同处理棉田土壤线虫群落的生态指数变化

方差分析表明,抗旱转基因棉013011与对照棉TH2处理棉田土壤线虫群落在多样性指数(H)、优势度指数(C)和均匀度指数(J)上均无显著差异(表4)。但抗旱转基因棉013011棉田土壤线虫属的物种丰富度(S)显著低于对照棉TH2(P<0.05),2个处理间线虫群落相似度达0.74±0.02。耐盐碱转基因棉013018与对照棉Q棉田土壤线虫的S、H、C和J均无显著差异,2个处理间线虫群落相似度达0.66±0.02(表4)。4个处理棉田土壤线虫多样性指数(S、H、C和J)在不同采样时间之间均无显著差异(表5)。

2014—2015年,抗旱、抗盐碱转基因棉分别与其对照棉之间棉田土壤线虫群落生态指数均无显著差异(表4)。抗旱转基因棉013011及其对照棉TH2棉田土壤线虫群落生态指数RNC、IM和IPP在不同采样时间之间存在极显著差异(P<0.01,表5)。而耐盐碱转基因棉田013018及其对照棉田土壤线虫群落生态指数在不同采样时间无显著差异(表5)。

表4转基因棉与对照棉田土壤线虫的群落生态指数

Table4Soilnematodecommunityecologicalindicesofthesoilsundertransgenicandnon-transgeniccottons

性状棉花品系SHCJRNCIWIMIPP 抗旱01301111.15±0.54a1.87±0.05a0.22±0.01a0.42±0.02a0.92±0.02a5.18±1.79a1.39±0.07a0.84±0.12a TH212.55±0.34b1.82±0.05a0.24±0.01a0.41±0.01a0.92±0.02a5.73±3.10a1.40±0.11a0.98±0.13a 耐盐碱01301814.10±1.07a2.04±0.08a0.19±0.02a0.46±0.02a0.94±0.01a3.94±0.76a1.46±0.07a0.77±0.09a Q13.10±0.81a2.01±0.08a0.20±0.02a0.44±0.02a0.95±0.01a4.19±1.05a1.45±0.07a0.83±0.10a

S为物种丰富度指数,H为多样性指数,C为优势度指数,J为Pielou均匀度指数,RNC为线虫通路指数,IW为Wasilewska指数,IM为成熟度指数,IPP为植食性线虫指数。转基因棉与其对照相比,同列英文小写字母相同表示两者间某指标在α=0.05水平上无显著差异(F检验),不同表示存在显著差异。

表5性状和采样时间对棉田土壤线虫群落生态指数的影响

Table5Soilnematodecommunityecologicalindicesofthesoilsincottoneldsrelativetocottontraitandsamplingtime

性状因素SHCJRNCIWIMIPP 抗旱性状4.61*0.421.630.560.000.020.010.67时间0.090.670.011.268.07**3.009.98**6.70**性状✕时间0.021.010.060.250.140.230.730.12 耐盐碱性状0.540.110.280.790.100.040.000.14时间0.440.010.220.260.470.172.281.16性状✕时间0.660.020.050.221.270.350.670.34

S为物种丰富度指数,H为多样性指数,C为优势度指数,J为Pielou均匀度指数,RNC为线虫通路指数,IW为Wasilewska指数,IM为成熟度指数,IPP为植食性线虫指数。*和**分别表示在α=0.05和0.01水平上存在显著差异。

3 讨论与结论

通过2 a的田间调查研究,2种抗逆转基因棉田土壤总的线虫群落结构及多样性指数与其相应受体对照田无显著差异,但与对照田相比,抗旱转基因棉田土壤食细菌线虫丰度发生显著变化,尤其是中杆属(Mesorhabditis)线虫丰度显著增加(P<0.05)。由于此次调查结果中抗旱转基因棉与其对照田存在显著差异的仅为个别食性及种属〔表2,食细菌线虫群落P<0.05;表1,中杆属(Mesorhabditis)线虫P<0.05,桑尼属(Thornia)线虫P<0.01〕,推测这可能是抗旱转基因棉对棉田线虫的影响存在食性间、种属间差异,但仍需进一步调查研究。另外,MANACHINI等[21]也曾指出Bt 油菜(Cry1Ac)与非Bt处理组相比,食真菌线虫比例升高,植食性线虫比例降低。戚琳等[13]发现种植Bt水稻提高了土壤线虫中植食性线虫和捕食杂食性线虫的比例。吴刚等[22]发现转Cry1Ab/c基因水稻华恢1号显著降低中杆属线虫种群数量,但显著增加钩唇属(Diploseapter)线虫种群数量。与常规对照亲本玉米比较发现,转植酸酶基因玉米处理总的线虫群落多样性及丰度无明显变化,但食细菌类线虫丰度及各多样性指数增加,植食类线虫丰度及各多样性指数降低[10]。由此可见,有些转基因植物确实可以对不同食性线虫丰度产生影响。因此,对转基因植物生态安全性进行评价时,选取敏感食性、种属的线虫作为评价指标是值得进一步深入研究的。

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