菌种对苜蓿发酵饲料主要成分及酶活性的影响

彭 蕊 王雅茹 王 媛

（1衡水学院生命科学系 河北 衡水 053000；2哈励逊国际和平医院 河北 衡水 053000；3衡水志豪畜牧科技股份有限公司 河北 衡水 053000）

紫花苜蓿是一种重要的饲草，分布广泛，品质优良，适口性好，所以有“牧草之王”的美称，但粗纤维含量高、蛋白质消化率低限制了其利用程度。对苜蓿浓缩蛋白的提取的研究虽然较为成熟，但更深层次的研究较少，整体利用率低。发酵可以一定程度上改善饲料的营养成分，提高牲畜利用率，同时由于益生菌及酶活性增加，其免疫性能也得到提高[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。酵母菌(yeast)、米曲霉(Asp.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均由衡水学院微生物学实验室提供。

1.1.2 原料。紫花苜蓿，由衡水志豪畜牧科技有限公司提供。

1.1.3 仪器。凯氏定氮仪(ATN-300型)，石墨消解仪(DS-360)，鼓风干燥箱(DHG-9075A)，超净工作台(JB-CJ-1500FX)，恒温培养箱(GHP-9160(A))。

1.2 方法

1.2.1 制备发酵原料。苜蓿洗净，烘干，用粉碎机粉碎，过40目筛。制备干发酵料(苜蓿∶油渣=17∶3)，分装于36个组培瓶中。18瓶121℃灭菌30 min，冷却，烘干。制备发酵原料(发酵料∶自来水=1∶2)。

1.2.2 菌种活化及培养。40℃葡萄糖水中活化菌种，接入PDA培养基，28℃培养箱培养。挑选生长良好的单菌落扩大培养(枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养)。

1.2.3 制备菌悬液。无菌水制菌悬液，经测定，酵母菌、枯草芽孢杆菌活菌数分别为5.1×109个/ml、1.25×109个/ml，米曲霉、黑曲霉孢子数为分别1.22×109CFU/ml、1.31 ×109CFU/ml。

1.2.4 接种与发酵。经灭菌处理的发酵原料按不接菌、接单菌(酵母菌、黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌)、接4种混合菌(各1.25 ml)进行处理，各3个重复。未灭菌原料相同。将接种好的组培瓶放35℃培养箱培养。

1.2.5 测定。在第0 d、5 d、10 d、15 d取产物，凯氏定氮法测定粗蛋白含量，酸性洗涤剂法测粗纤维含量，用DNS法测还原糖含量，计算纤维素酶活力。

2 结果与分析

2.1 粗蛋白含量。经测定得知发酵前粗蛋白含量为14.6%。由表1～3可知，自然发酵下粗蛋白增率低于灭菌发酵。单就各菌种而言，黑曲霉最佳，而混菌发酵又优于单菌发酵。综合分析发现，发酵5 d、10 d、15 d中蛋白含量呈递增趋势。

表1 发酵5 d粗蛋白含量 (单位：%)

表2 发酵10 d粗蛋白含量 (单位：%)

表3 发酵15 d粗蛋白含量 (单位：%)

2.2 粗纤维含量。经测定得知发酵前粗纤维含量为38%。由表4～6可知，自然发酵下粗纤维减少程度高于灭菌条件。单菌中黑曲霉最佳，而混菌发酵又优于单菌发酵。5 d、10 d、15 d中粗纤维减少程度逐渐增强。

表4 发酵5 d粗纤维含量 (单位：%)

表5 发酵10 d粗纤维含量 (单位：%)

表6 发酵15 d粗纤维含量 (单位：%)

2.3 纤维素酶活性。经测定得知发酵前纤维素酶活力为15 U/g。由表7～9可知，自然发酵下纤维素酶活性增率低于灭菌条件。单菌中黑曲霉最佳，混菌发酵优于单菌发酵。5 d、10 d、15 d中酶活性呈递增趋势。

表7 发酵5 d纤维素酶活力

表8 发酵10 d纤维素酶活力

表9 发酵15 d纤维素酶活力

3 讨论

混菌发酵充分利用各菌优势，不同菌种可以互补不足。酵母菌可生产单胞蛋白，菌体蛋白饲喂试验效果明显[2]。由于酵母菌不能利用多糖为碳源，所以在只接酵母菌的发酵原料中粗蛋白含量增长较慢。试验结果表明，产物中粗纤维含量下降，这是由于各微生物酶系的相互作用导致的。如黑曲菌与米曲霉发酵过程中可产生纤维素酶、淀粉酶等十几种酶类，这些酶水解活性好，可促进饲料中纤维素等成分降解，提高饲料利用率[3]。随时间延长，微生物不断繁殖产生菌体蛋白、消耗粗纤维等，使苜蓿饲料的营养成分及酶活性发生变化。对苜蓿饲料的长时间发酵及利用有待进一步研究以指导生产实践。

[1]皮祖坤.生物蛋白饲料研究 [J].中国饲料，2004(9)： 38～40.

[2]郑奋新.菌体蛋白生物饲料在养猪生产中的应用研究 [J].福建畜牧兽医，2003，25(Z1)：17～18.

[3]李明，双宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用 [J].东北农业大学报，2009，40(9)：111～114.