大黄鱼微卫星DNA标记的开发及其研究进展

李宇生

摘 要：本文通过概述了大黄鱼微卫星标记开发现状的研究成果和应用进展，以期为微卫星标记方法在水产养殖遗传学研究方向的发展提供基础资料。

关键词：大黄鱼 ； 微卫星标记 ； 研究

大黄鱼，硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，黄鱼属。又名黄鱼是我国重要的海水养殖鱼类，曾有中国“海洋四大经济鱼类”之称。大黄鱼肉质较好且味美，鱼鳔可干制成名贵食品“鱼肚”，又可制“黄鱼胶”。大黄鱼肝脏含维生素A，为制鱼肝油的好原料。耳石可作药用。自1987年突破人工繁殖以来，大黄鱼养殖规模和范围不断扩大，至2010年，已形成年产8.6 万吨，产值约65 亿元的产业。但是，在大黄鱼人工养殖与繁育中发现其经济性状，尤其是鱼肉品质及抗病力等方面出现了比较严重的衰退。分析大黄鱼的遗传多样性，对保护和利用资源，建立良种培育体系有重要意义。

随着分子生物学的发展，人们开发了RAPD、RFLP、AFLP等标记，由于微卫星标记有优于其它标记的诸多特点，在遗传图谱的构建、遗传多样性分析和种质鉴定等方面得到广泛的应用。微卫星DNA，又称短串联重复序列或简单序列重复，是以1-6个核苷酸为基本单位（核心序列），首尾相连组成的串联重复序列。根据核心序列排列方式的不同，Weber等将微卫星分为完全、不完全和复合型三类。（1）完全型微卫星是指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成；（2）不完全型微卫星是指在微卫星的核心序列之间有3个以下的非重复碱基，但其两端的连续的核心序列重复数大于3；（3）复合型微卫星是指两种或两种以上的串联核心序列由3个或3个以上连续的非重复碱基分隔开，连续的核心序列重复数不少于5。由于核心序列的重复数不同，引起了物种间，甚至种内不同个体间微卫星位点的多态性。研究表明， 不同的物种微卫星的含量和分布各不相同，并且微卫星的重复类型在不同的生物中也差异很大。

微卫星标记属于特异性标记，其引物开发要在明确物种DNA序列的前提下进行，所以开发成本较大。目前从动物基因组中获得微卫星标记的途径有多种，以下方法被用于大黄鱼微卫星DNA标记的开发中。

一、从DNA文库中开发

生物信息学技术是微卫星DNA分子标记开发的有力工具之一。目前，东方红鳍豚、文昌鱼和海胆等海产动物的全基因组测序已完成，积累了大量的基因组序列和表达序列标签（expressed sequence tag，EST）数据，NCBI，EMBL，DDBJ和GDB等数据库为微卫星标记的开发提供了丰富的资源。大黄鱼EST序列有4200个在GenBank上注册。基于生物信息学技术开发SSR标记的基本流程包括，从公共基因数据库（如EMBL、GenBank和DDBJ等）下载DNA序列（多为EST数据），然后利用相应软件寻找含有SSR的序列，最后根据其两端的保守性序列设计SSR引物并进行扩增验证。

谢芳靖等通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA 文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4.24%；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53.3%。在这些微卫星序列中，（TG/GT/AC/CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG/AGG/GGA/CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26%和14%。选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR 扩增，2.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12.9%。李红梅等通过对大黄鱼全基因组中的微卫星重复序列进行搜索，在长度为619Mbd的大黄鱼基因组中，共发现68008个微卫星重复序列，其序列总长度约占全基因组序列的0.47%。共发现单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸等6种微卫星类型，在微衛星序列中，二核苷酸重复序列最多，约占微卫星序列总数的71.03%，四核苷酸重复类型排在第二位，占11.88%。而在二核苷酸重复类型中，以AC基序列含量最多，占到二碱基重复类型的90.18%。

二、基因组文库富集法

为提高开发微卫星标记的效率，降低成本，许多科研人员研发了不同的技术，构建SSR富集文库。将基因组DNA经酶切后与微卫星探针杂交，使标记在探针上的生物素与磁珠表面的链亲和素之间结合，或固定在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，就可将微卫星富集，通过克隆和测序得到微卫星DNA，此种方法提高了获得阳性克隆的效率，富集效率可达到50%-90%。

郭葳等采用生物素——磁珠富集微卫星，构建筛选了部分的大黄鱼的微卫星文库，分离得到36个微卫星标记；郝君等同样采用磁珠富集微卫星，与传统放射性同位素杂交法相结合，筛选出22对可用引物。

三、其他方法

以RAPD为基础的PCR法，将RAPD扩增片段转移至膜上，与微卫星探针杂交，获得阳性RAPD片段后进行克隆。林能锋等以M13通用引物和根据微卫星核心序列所设计的引物，用PCR 法直接对文库进行扩增，获得15个PCR阳性克隆，对阳性克隆测序。宁岳等以拟侧交法构建了大黄鱼第一代遗传连锁图谱，其中就包含有15个微卫星标记。李红梅等通过在完整的微卫星序列侧翼设计引物，进行扩增，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，共成功筛选出73对微卫星引物。

四、结语

研究表明，微卫星DNA标记较其他标记有众多优势：微卫星位点的等位基因数目多，多态性信息量大；目前，大黄鱼有较多的可利用的微卫星引物，而且在遗传多样性方面研究较多，因此对开展大黄鱼经济性状的QTL定位、分子标记辅助育种方面的研究是很有必要的。